靶向修饰CUL3基因顺式元件恢复外显子9包含治疗Gordon综合征的研究

《Human Genomics》：Targeted modification of cis-elements in the CUL3 gene to restore exon 9 inclusion for treating Gordon syndrome

本研究针对Gordon综合征中CUL3基因外显子9跳跃的致病机制，通过生物信息学预测和实验验证，发现内含子8的AA(-9,-10)TT置换和外显子9的A18G置换能有效恢复外显子包含。AA(-9,-10)TT通过延长Py-tract增强U2AF2结合，而A18G通过削弱hnRNP A1抑制实现剪接矫正，为剪接相关疾病提供了新的治疗策略。

　　

在遗传性疾病研究领域，基因剪接异常已成为重要的致病机制。据统计，约25-50%的点变异通过影响正常剪接导致疾病，其中外显子跳跃是最常见的错误剪接形式，占异常剪接事件的30-40%。Gordon综合征（又称假性醛固酮减少症II型）作为一种罕见遗传病，其最严重的表型与CUL3基因突变密切相关。值得注意的是，该基因外显子9的弱剪接受体位点（acceptor splice site, AS）使其容易受周边剪接环境干扰，导致外显子9跳跃，进而产生缺失57个关键氨基酸的致病蛋白。

目前针对剪接异常疾病的治疗策略如反义寡核苷酸（antisense oligonucleotides, ASOs）存在需多次给药、费用昂贵等局限性。而基因编辑疗法大多仅能纠正单个特定变异，难以广泛应用于患者群体。因此，开发针对疾病剪接机制的创新策略具有重要意义。

在这项发表于《Human Genomics》的研究中，石晓蒙团队通过系统性的实验验证，揭示了两个新的潜在治疗靶点：内含子8区域的AA(-9,-10)TT置换和外显子9区域的A18G置换。这些发现为开发Gordon综合征的通用治疗策略提供了重要理论基础。

研究人员主要运用了生物信息学预测、微型基因（minigene）剪接分析、电泳迁移率实验（electrophoretic mobility shift assay, EMSA）、CRISPR/Cas9介导的内源性细胞系构建以及RNA结合蛋白免疫沉淀（RNA binding protein immunoprecipitation, RIP）等关键技术方法。其中，患者变异信息来源于人类基因突变数据库（Human Gene Mutation Database）和ClinVar数据库（截至2022年8月）。

内含子拯救靶点的预测与验证

通过BDGP（Berkeley Drosophila Genome Project）软件对内含子8区域（从c.1207-3到c.1207-10）进行逐步核苷酸置换预测，发现A(-9)T、A(-10)T及其双置换AA(-9,-10)TT能显著提高AS评分。微型基因实验证实，这三个核苷酸置换形式几乎能完全挽救由AS区域附近变异引起的外显子9跳跃，其中AA(-9,-10)TT效果最佳。

剪接拯救机制解析

研究表明，AA(-9,-10)TT置换能将Py-tract序列从UCUUAAUUUU延伸为UCUUUUUUUU，从而增强与剪接因子U2AF2的结合亲和力。EMSA实验显示突变型RNA（Mut-RNA）与U2AF2的结合能力显著强于野生型（WT-RNA）。分子对接预测也表明，Mut-RNA与U2AF2能形成更紧密的空间结构。

内源性细胞模型验证

通过HDR-CRISPR/Cas9技术构建的G30A突变细胞系证实，AA(-9,-10)TT和A18G均能完全恢复外显子9的正常剪接。RIP实验进一步表明，AA(-9,-10)TT能促进U2AF2与CUL3前mRNA的结合，而A18G则能减弱剪接抑制因子hnRNP A1的结合。

讨论与展望

本研究首次系统阐明了通过靶向修饰顺式元件调控CUL3基因剪接的分子机制。AA(-9,-10)TT通过扩展Py-tract增强U2AF2结合，而A18G通过干扰hnRNP A1抑制来恢复剪接平衡。这两种策略分别从增强剪接活性和解除剪接抑制两个角度，为外显子跳跃疾病的治疗提供了新思路。

值得注意的是，靶向内含子元件的编辑比外显子编辑更为安全。随着基因编辑技术的发展，精确修饰保守的顺式元件将为长效个性化治疗策略提供可能。尽管本研究在细胞模型上验证了靶点的有效性，但后续仍需在动物模型中进行验证，并探索具体的治疗方式，如剪接转换反义寡核苷酸或基因编辑等。

该研究不仅为Gordon综合征的治疗提供了新的候选靶点，更重要的是提出了一种针对剪接异常疾病的通用治疗策略，为相关疾病的基础研究和临床转化开辟了新方向。