综述：从IscB到Cas9：新一代微型基因编辑工具的工程化进展与前沿

《Biotechnology Advances》：From IscB to Cas9: Engineering and advances in the next generation of miniature gene editing tools

本综述系统梳理了从转座子相关核酸酶IscB（Cas9的进化祖先）到现代CRISPR-Cas9系统的演进脉络，重点阐述了IscB（约400-500 aa）相较于SpCas9（~1368 aa）的微型化优势及其在解决基因编辑工具（如碱基编辑器BEs、先导编辑器PEs）体内递送（尤其是AAV载体包装容量限制）这一关键瓶颈中的应用潜力。文章详细比较了OgeuIscB与SpCas9的结构域组成和切割机制，总结了通过理性设计、定向进化等策略对IscB系统进行工程化改造以提升其在真核细胞中的编辑效率、特异性及开发新型编辑器的最新进展，并展望了基于IscB的微型化工具未来的优化方向。

　　

从IscB到Cas9：微型基因编辑工具的演进与工程化突破

基因编辑技术，特别是CRISPR-Cas系统，以其模块化、可编程性和高精度，彻底改变了生命科学研究和生物医学应用的面貌。然而，将庞大的编辑工具高效、安全地递送到目标细胞，尤其是使用具有包装容量限制的腺相关病毒（AAV）载体时，仍是临床转化面临的主要挑战。寻找体积更小的替代编辑器成为当务之急。近期，科学家们发现转座子相关核酸酶IscB是Cas9的进化祖先，其尺寸仅为Cas9的三分之一左右（约400-500个氨基酸），这为开发新一代微型基因编辑工具打开了新的大门。

The OMEGA family: Origin of class II CRISPR-Cas systems

可移动遗传元件是基因组多样化和生物进化的重要驱动力。研究发现，CRISPR组件可被各类可移动遗传元件招募利用。其中，转座子是一个主要类别，它们通过“剪切-粘贴”或“复制-粘贴”机制在细胞内移动序列。OMEGA系统，即Obligate Mobile Element Guided Activity，是一类与转座子相关的、由可编程RNA（称为ωRNA）引导的紧凑型核酸酶家族，被认为是II类CRISPR-Cas系统的起源。

Transposition function of IscB and evolutionary path to Cas9

IscB属于IS200/IS605转座子超家族的一个独特进化分支，是一种RNA引导的归巢内切酶，在转position过程中作为辅助因子发挥作用，其过程可用“剥离-粘贴，切割-复制”模型来描述。大规模基因组挖掘显示，只有约1.5%的IscB同源物与典型的HUH家族Y1转posase相关联，这表明其功能存在多样性。从IscB到Cas9的进化路径，揭示了自然界如何将一种与转座子相关的防御或调控模块，改造成为适应性免疫系统的核心元件。

Comparison of the domain architectures and cleavage mechanisms of SpCas9 and OgeuIscB

对源自人类肠道微生物组的OgeuIscB的晶体结构解析，揭示了其与SpCas9在结构域组织和作用机制上的异同。OgeuIscB虽小，但包含了与Cas9同源的核心结构域：负责切割靶链的HNH结构域和负责切割非靶链的RuvC结构域（RuvC I–III）。与Cas9使用单一的sgRNA不同，IscB依赖于ωRNA进行引导。在切割机制上，两者都通过识别原型间隔序列邻近基序（PAM）来启动靶标结合和切割，但IscB的PAM偏好性和识别机制可能更为原始或具有独特性，这也是当前工程化改造的重点之一。

Engineering modification of the IscB system

天然IscB系统在真核细胞中的编辑效率有限（例如OgeuIscB的插入缺失效率仅为0.1–2%），且在不同靶位点活性波动大，其较短的引导序列长度也增加了潜在的脱靶风险。因此，对IscB系统进行工程化改造至关重要。目前的策略主要包括：

1. 1.
   蛋白质工程： 通过理性设计或定向进化方法，对IscB蛋白的关键氨基酸进行突变，以增强其催化活性、改善PAM识别范围（如开发出识别更宽松PAM的变体）、提高热稳定性及特异性。
2. 2.
   ωRNA工程： 优化ωRNA的序列和结构，例如延长其引导序列长度、引入G₁-C₁错配等修饰，以提升其与靶DNA的结合稳定性和特异性，从而减少脱靶效应。
3. 3.
   开发新型编辑器： 借鉴CRISPR系统的成功经验，将催化失活的IscB（dIscB）与各种效应结构域融合。例如，将脱氨酶与缺口酶IscB（nIscB）融合，成功构建了IscB碱基编辑器（IscB-BE），能够实现精确的碱基转换（如C→T或A→G）。未来，开发IscB先导编辑器（IscB-PE）等更精确的工具也是重要方向。

Application of gene editing tools developed by the IscB system

经过工程化改造的IscB系统已在哺乳动物模型中展现出应用潜力。例如，通过显微注射将靶向Pcsk9基因位点的工程化IscB（eIscB-D）系统组分递送到小鼠胚胎中，成功获得了具有预期基因型的小鼠模型，证明了其体内编辑能力。IscB-BE也在细胞水平实现了高效的碱基编辑。这些初步应用表明，基于IscB的微型编辑器在基因治疗、疾病模型构建及功能基因组学研究等领域具有广阔前景。其小巧的体积使其易于与指导RNA一起被包装进单个AAV载体中，有望简化递送方案，提高治疗的安全性和效率。

Conclusions and outlook

IscB作为一类新兴的微型基因编辑工具平台，其最大的优势在于尺寸紧凑，完美契合了AAV等递送载体的容量限制。尽管天然系统存在效率不高、特异性有待优化等局限，但通过持续的蛋白质与RNA工程，其编辑性能已得到显著提升。未来，对IscB的优化将集中于进一步拓宽其靶向范围、提高编辑精确度、降低脱靶效应，并开发更多样化的编辑器类型（如表观遗传编辑器、先导编辑器）。同时，深入理解其与Cas9在进化、结构和机制上的联系，不仅能推动IscB本身的发展，也将为理解CRISPR系统的起源和进化提供重要启示。随着工程化技术的不断进步，基于IscB的微型基因编辑工具有望成为CRISPR-Cas9系统的重要补充，共同推动精准医学的发展。

Funding sources

本研究未收到任何公共、商业或非营利部门资助机构的特定资助。

Declaration of competing interest

作者声明无利益冲突。

Acknowledgements

感谢实验室所有成员在团队工作中的合作。