综述：昆虫害虫控制中条件性性别转换系统的研究进展

《Current Opinion in Insect Science》：Conditional Sex Conversion Systems for Improved Control of Insect Pests

本综述系统评述了利用条件性性别转换系统提升昆虫不育技术(SIT)效能的最新进展。文章重点分析了温度诱导型(如tra2ts2突变体)和四环素调控型(Tet-Off)两大技术路径，探讨了通过调控transformer(tra)、doublesex(dsx)等关键基因实现雌性向雄性转换的分子机制，并指出剂量补偿机制是当前技术面临的主要挑战。作者强调，结合高质量基因组数据和新型基因编辑工具，未来有望开发出更精准高效的害虫防控策略。

　　

温度诱导型条件性别转换系统

近年来，研究人员开发了多种利用温度变化触发雌性昆虫雄性化的条件性别转换系统。在地中海实蝇（Ceratitis capitata）和斑翅果蝇（Drosophila suzukii）中，科学家通过CRISPR-Cas9技术在transformer-2（tra2）基因中引入点突变，获得了温度敏感型tra2^ts2突变体。该突变导致TRA2蛋白在高温下不稳定而失活。TRA2蛋白是许多昆虫性别决定通路的关键组分，它与transformer（tra）蛋白形成复合物，共同调控下游靶基因（如doublesex，dsx）的雌性特异性剪接。

在斑翅果蝇中，携带纯合tra2^ts2突变的雌性个体在26-29°C的高温下饲养时，可被可靠地雄性化。然而，此高温条件也导致两性完全不育，且存活率极低（5-10%）。通过调整饲养策略（先在22°C培养9天，再转移至26°C或29°C），存活率可提升至80-90%。在此条件下，XY雄性完全不育，而XX个体则表现为间性且不育，这对于SIT项目而言具有优势，因为间性个体无需进行辐射绝育，且不会在田间与野生雌性竞争释放的绝育雄性。

在地中海实蝇中，纯合tra2^ts2突变体在高温下也能实现完全的雌性向雄性转换。但该系统面临维持种群的难题：在足以保持TRA2稳定、抑制性别转换的低温下，果蝇无法正常繁殖。由于无法维持纯合的性别转换品系，该系统目前尚不能用于SIT。不过，该方法在能够耐受较宽温度范围且TRA2参与性别决定的昆虫（如铜绿蝇 Lucilia cuprina）中仍有评估价值。

另一种温度诱导型性别转换系统在黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）中实现，称为TI-pgSIT（温度诱导型精准引导不育昆虫技术）。该系统利用热敏启动子（hsp70）驱动Cas9在高温下的表达，同时组成型表达靶向雌性存活（Sex lethal, Sxl）、雌性发育（transformer, tra）和雄性生育力（β2tubulin, β2tub）关键基因的向导RNA（gRNA）。根据饲养温度和遗传背景的不同，TI-pgSIT品系中的雌性表现出从部分到完全雄性化乃至致死等多种表型。与tra2^ts2品系不同，TI-pgSIT品系能够耐受高温并在低温下继续繁殖，尽管存在一定程度的Cas9渗漏表达。这表明利用热诱导启动子作为温度敏感开关，可在其他昆虫中实现基于CRISPR的条件性性别转换。斑翅果蝇是一个明显的候选者，因为利用hsp70启动子的温度依赖性Cas9表达品系已在该物种中建立。

Tet-Off系统用于条件性性别转换

除了温度诱导系统，Tet-Off性别转换系统也在几种害虫昆虫中得以开发。Tet-Off系统的工作原理是表达四环素反式激活因子（tTA）蛋白，该蛋白与效应基因启动子上游的tet操纵子（tetO）序列结合，从而激活效应基因的表达。当存在四环素类药物时，tTA无法结合tetO，效应基因的表达被抑制到仅由基础核心启动子驱动的低水平。

首个在昆虫中描述的Tet-Off性别转换系统针对澳大利亚铜绿蝇（Lucilia cuprina）。该系统使用在卵巢和胚胎中具有活性的tTA驱动品系，来驱动靶向transformer同源基因（Lctra）的双链RNA（dsRNA）的表达。如果从母体和幼虫饲料中同时去除四环素，在某些纯合品系中，Lctra的敲低导致了雌性的完全雄性化。然而，完全雄性化的雌性在蛹晚期死亡。这很可能是由于剂量补偿的失调，因为RNA测序和qRT-PCR分析显示XX蛹中X染色体基因过度表达。剂量补偿是生物体平衡两性间基因表达水平的过程。在铜绿蝇中，Lctra似乎同时控制着剂量补偿和性别决定。找到能够将雌性转变为雄性而又不致致命性破坏剂量补偿途径的合适靶基因，是研究人员创建性别转换系统的主要障碍。

后续研究表明，通过调整效应基因干扰的方法或时机，有可能实现无致死性的性别转换。例如，在上述铜绿蝇研究中，携带两个拷贝Lctra基因组敲入突变的雌性能够完全雄性化且可存活，这与表达LctradsRNA的雌性不同，推测原因是敲入突变体没有降解启动剂量补偿所需的母源沉积的Lctra转录本。最近，研究人员建立并测试了多种利用Cas9或dCas9靶向Lctra和两个标记基因的Tet-Off性别转换品系。dCas9（“死亡”Cas9）是Cas9的催化失活版本，它能持久结合靶基因（或其启动子），在不编辑DNA的情况下阻断转录。出乎意料的是，dCas9的表达导致了广泛的致死性，并且未能如预期那样实现基因敲低。相比之下，Cas9表达被良好耐受，并导致其中一个标记基因的稳健敲除。然而，该系统未能使雌性雄性化，很可能是因为基于多重tRNA的gRNA表达平台未能释放足够量的靶向Lctra的gRNA。重新设计Cas9 Tet-Off性别转换构建体，使每个gRNA在独立的U6启动子控制下表达，或许能使条件性性别转换在铜绿蝇中成为可能，但这仍有待验证。最近在地中海实蝇中报道了使用单重、靶向Cctra的gRNA成功实现基于CRISPR的性别转换，证明了该方法的可行性。

在斑翅果蝇中也采用了与上述策略类似的Tet-Off系统进行条件性性别转换。tTA被用来驱动包含完整Dstra编码序列的反向重复序列的表达。然而，这并未激活RNAi通路导致Dstra敲低，反而在雄性中异位表达了Dstra，使其雌性化。雌性化的雄性对于SIT并无用处，但通过表达基于较小Dstra片段（而非完整编码序列）的dsRNA或shRNA，该系统可能被改造用于诱导雌性向雄性的转换。

在某些害虫昆虫中，异位表达雄性决定基因可将雌性转变为雄性而不致死，而在另一些昆虫中则会导致致死。迄今为止，仅报道了一种利用异位表达雄性决定基因的条件性性别转换系统：在埃及伊蚊（Aedes aegypti）中表达Nix基因的Tet-Off系统。该系统实现的Nix表达水平出乎意料地低，导致雌性仅部分而非完全转变为雄性。在非条件性系统中，利用Nix自身启动子驱动其表达，已实现了埃及伊蚊和白纹伊蚊（Aedes albopictus）雌性的完全转换。修改埃及伊蚊Tet-Off系统的调控元件（如tTA启动子或tetO序列的数量）可能会提升Nix表达水平，从而实现完全转换。

最新进展与未来机遇

所有现有的害虫昆虫条件性性别转换系统都面临着阻碍其应用于SIT防控的障碍。然而，新的研究为科学家提供了更多的遗传工具和知识，以改进现有系统或创建新系统。

例如，改进的piggyBac介导的转基因方法、利用细菌重组酶进行靶向转基因的方法不断涌现。高质量长读长DNA测序技术的进步催生了许多害虫昆虫（及其近缘类群蜱）的新基因组组装和转录组数据。这将有助于精确定位潜在的初级性别决定信号，这些信号在昆虫中通常保守性差、变异性高。基因编辑技术的进步，如ReMOT-control（受体介导的卵巢货物转运），将使得测试参与性别决定的候选基因成为可能。高质量昆虫基因组组装的可用性也有助于研究人员鉴定和表征选择性标记基因及调控元件（如U6启动子），这将促进转基因性别转换品系的创建。

除了Tet-Off和温度诱导方法，还有其他条件性基因表达系统可供考虑。例如，奎尼酸系统（Q-system）在黑腹果蝇中被广泛用于基因表达控制。它比Tet-Off系统更复杂，但诱导剂奎尼酸无毒。另一种利用植物激素生长素作为诱导剂的条件性系统也显示出控制基因表达的潜力。甚至可能通过改进Tet-Off系统实现更精细的控制，例如为哺乳动物细胞开发的光激活Tet-Off系统可提供精确的时序基因表达控制。

鉴于该领域的最新进展，有效的条件性性别转换系统似乎触手可及，并可能极大地助力于对抗害虫昆虫的斗争。