综述：CRISPR与表观遗传双向调控：从互作机制到治疗潜力

《Computational and Structural Biotechnology Journal》：CRISPR-epigenetic crosstalk: from bidirectional regulation to therapeutic potential

这篇综述系统阐述了CRISPR系统与表观遗传修饰之间的双向互作，创新性地提出了“CRISPR-表观遗传调控回路”模型。文章详述了表观遗传景观（如DNA甲基化、组蛋白修饰）如何影响CRISPR（Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats）编辑效率，同时揭示了CRISPR（尤其是dCas9系统）作为强大的表观遗传编程工具的潜力。核心突破包括将CRISPR确立为主动的表观遗传编程器、合成表观遗传预适应治疗范式以及首个预测模型EPIGuide的阐明，为优化sgRNA（single guide RNA）设计、开发序贯疗法开辟了新途径。

　　

1. 引言

表观遗传修饰，包括DNA甲基化、组蛋白翻译后修饰和非编码RNA介导的调控，代表了基因组控制的关键层面，它们能在不改变底层DNA序列的情况下动态影响基因表达。这些机制从根本上塑造了细胞身份、分化和组织稳态，其失调与疾病发病机制密切相关。例如，在癌症中，肿瘤抑制基因启动子的高甲基化可导致其转录沉默，从而促进不受控制的增殖和转移。

与此同时，成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）系统已从一种适应性细菌免疫系统演变成一个多功能生物技术平台。虽然最初以其基因编辑能力闻名，但CRISPR技术已迅速扩展到功能基因组学、染色质成像，尤其是表观遗传工程领域。其中一个关键创新是核酸酶失活的Cas9（dCas9），它作为一个可编程的DNA结合模块。通过将dCas9与各种表观遗传效应结构域融合，研究人员现在能够进行精确的位点特异性修饰。

值得注意的是，CRISPR与表观遗传学的关系并非单向的。细胞表观遗传景观对CRISPR活性产生深远影响。例如，DNA甲基化会损害Cas9结合并降低编辑效率，特别是当靶位点位于高度甲基化的CpG岛时。类似地，组蛋白修饰调节染色质可及性：抑制性标记如H3K27me3会使染色质压缩并阻碍Cas9接近，而乙酰化的组蛋白通常与增强的编辑结果相关。

这种互惠关系，即CRISPR系统可以重写表观遗传状态，而预先存在的表观遗传状态又约束或促进CRISPR活性，构成了我们称之为“CRISPR-表观遗传调控回路”的基础。这种动态的闭环模型挑战了将CRISPR视为被动工具的传统观点，并将其重新定义为既是表观遗传调控的效应器也是其靶标。

2. CRISPR-Cas系统

2.1. 功能架构与进化多样性

CRISPR/Cas系统是原核生物中的一种适应性免疫机制，利用由保守重复序列和源自入侵核酸的可变间隔序列组成的CRISPR阵列，产生CRISPR来源的RNA（crRNA）用于序列特异性病原体中和。在再感染时，crRNA与Cas核酸酶复合物通过原间隔相邻基序（PAM）依赖性靶向识别互补的病毒序列，触发外来DNA或RNA的切割。进化多样化产生了两大类：1类系统（I型、III型和IV型）利用多蛋白效应器复合物，而2类系统（II型、V型和VI型）依赖单一效应蛋白，如Cas9和Cas12a。2类系统因其简单性而主导了基因组编辑应用。

2.2. 2类效应器的机制

Cas9和Cas12a体现了2类系统的功能特化。Cas9（II型）需要双RNA复合物进行DNA识别，并在PAM（NGG）处产生平末端双链断裂（DSBs）。相比之下，Cas12a（V型）通过单个crRNA操作，切割DNA产生粘性末端，并识别富含T的PAM（TTTV），从而能够靶向不同的基因组景观。

2.3. CRISPR-Cas机制与表观遗传串扰

当在真核细胞中部署时，CRISPR活性受到天然染色质环境的强烈影响。染色质可及性、DNA甲基化和组蛋白修饰显著调节Cas蛋白结合和编辑效率。例如，以高DNA甲基化或抑制性组蛋白修饰（如H3K9me3）为标志的异染色质会阻碍Cas9的接近，而富含H3K27ac的开放染色质区域则有利于高效编辑。

为了在不诱导DNA断裂的情况下利用CRISPR进行表观遗传工程，开发了催化失活变体。通过使HNH和RuvC核酸酶结构域失活的点突变产生的dCas9，可作为可编程的DNA结合支架。通过将dCas9与表观遗传效应结构域（如甲基转移酶、乙酰转移酶或去甲基化酶）融合，可以实现靶向表观基因组编辑。这种方法，广义上称为Epi-CRISPR，能够在特定位点精确操纵DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质结构。

表观遗传背景也影响CRISPR诱导DSB后DNA修复途径的选择。易出错的非同源末端连接（NHEJ）在异染色质区域更受青睐，而同源定向修复（HDR）在转录活跃的常染色质中更有效。这种偏向对治疗性基因组编辑提出了挑战，因为许多疾病相关位点位于抑制性染色质域内。

值得注意的是，染色质状态与编辑效率之间的关系可以被治疗性地利用。一个令人信服的例子是表观遗传预适应，即在基因编辑之前进行靶向染色质重塑。

3. CRISPR驱动的表观基因组工程

基于CRISPR的表观基因组工程彻底改变了我们 interrogate 和治疗性调节基因调控网络的能力。通过利用与表观遗传效应器融合的核酸酶缺陷型Cas蛋白，研究人员现在可以在不改变DNA序列的情况下实现精确的转录控制和染色质重塑。

CRISPR干扰（CRISPRi）和CRISPR激活（CRISPRa）系统已成为绘制功能性表观遗传元件图谱不可或缺的工具。这些平台揭示了关键的3D染色质枢纽和疾病发病机制的主要调控因子。例如，CRISPRi筛选通过MYB在维持染色质环中的作用，将其识别为白血病进展的关键调控因子；而CRISPRa介导的特定增强子激活使得能够将成纤维细胞直接重编程为心血管祖细胞。

表观遗传编辑的治疗潜力正在多种疾病背景中被探索。在血液疾病中，CRISPR-Cas9敲除造血干细胞中的BCL11A增强子，在提高胎儿血红蛋白水平以治疗β-血红蛋白病方面已显示出临床疗效。在肿瘤学中，多种方法显示出前景：dCas9-KRAB融合通过靶向转录抑制抑制前列腺癌生长；USP48敲除与低甲基化剂在急性髓系白血病中协同作用；dCas9-p300介导的组蛋白乙酰化通过调节细胞可塑性抑制结直肠癌的转移。

除了DNA靶向系统，基于CRISPR的RNA表观遗传编辑平台能够精确操纵RNA修饰，如m⁶A、m¹A和m⁵C。这些工具揭示了表观转录组调控在癌症进展中的关键作用。

4. 表观遗传对CRISPR系统的反作用

CRISPR介导的基因组编辑的功能结果深受靶细胞天然表观遗传景观的影响。本节系统性地考察了关键染色质特征（包括核小体定位、DNA甲基化和组蛋白修饰）如何控制CRISPR活性和DNA修复途径选择，并讨论了克服这些表观遗传限制的新兴策略。

染色质的物理压缩是CRISPR活性的基本屏障。异染色质区域内密集堆积的核小体在空间上阻碍Cas9-sgRNA复合物与其靶DNA序列的结合，显著降低切割效率。相比之下，以稀疏核小体占据和高染色质可及性为特征的常染色质区域允许强大的Cas9结合和编辑。

除了可及性之外，特定的表观遗传修饰通过不同的机制微调CRISPR结果：DNA甲基化。虽然不直接阻止Cas9-DNA结合，但启动子或增强子区域中的CpG甲基化会招募甲基结合蛋白和相关阻遏复合物，这些复合物压缩局部染色质结构并间接降低编辑效率。组蛋白修饰。组蛋白乙酰化促进开放染色质状态，并显著增强Cas9结合效率和HDR。相反，抑制性组蛋白甲基化标记维持染色质压缩，并有利于易出错的NHEJ而非HDR。

表观遗传的决定性作用推动了复杂计算工具的发展，这些工具整合多组学特征来预测sgRNA功效。早期工具如CHOPCHOP主要依赖序列背景，而当代机器学习框架，包括DeepCRISPR、CRISPRscan和EPIGuide，利用表观遗传特征，如染色质可及性、组蛋白修饰图谱和DNA甲基化模式。这些表观基因组感知模型将sgRNA功效预测准确性比仅基于序列的方法提高了32-48%。

对表观遗传限制的理解激发了治疗策略，以瞬时操纵染色质景观来改善编辑结果。药理学干预，例如使用HDAC抑制剂增强HDR或使用EZH2抑制剂减少抑制性H3K27me3标记，可以创造一个更宽松的CRISPR编辑环境。

5. 合成CRISPR-表观遗传调控回路

前面部分呈现的大量证据表明，CRISPR系统与表观基因组之间的相互作用超越了单向因果关系，形成了一个动态的、自我强化的CRISPR-表观遗传调控回路。该模型假定CRISPR活性既受表观遗传景观塑造，又主动重塑表观遗传景观，从而产生严重影响编辑结果和治疗效果的反馈回路。

回路模型得到多条实验证据的支持，证明了功能互惠性。首先，预先存在的表观遗传状态对CRISPR效率施加直接控制：异染色质阻碍Cas9接近，而常染色质增强其接近。其次，CRISPR系统本身作为有效的表观遗传编程器发挥作用；dCas9-效应器融合能够精确操纵DNA甲基化、组蛋白修饰和高阶染色质结构。最有力的验证来自序贯编辑策略。

该回路模型为克服基因组编辑中的一个主要挑战提供了合理的框架：异染色质区域的固有抵抗性。它将表观遗传屏障从一个被动的障碍转变为一个主动的治疗靶点。表观遗传预适应的策略，即在使用遗传干预之前使用dCas9为基础的编辑器将染色质重塑为更允许的状态，不仅已在肿瘤学中成功应用，而且在增强抑制性位点的基因校正方面也得到应用。

6. 结论与展望

本综述整合了支持CRISPR-表观遗传调控回路模型的证据，该模型将CRISPR系统概念化为既是表观遗传调控的效应器也是其靶标。确立这种双向关系的关键发现包括：药理学HDAC抑制通过染色质解压缩增强Cas9结合效率；CRISPR诱导的HDAC6功能障碍改变更广泛的表观遗传控制；以及通过表观遗传调节剂组合协同增强同源定向修复。整合计算工具如EPIGuide进一步验证了这种调控回路的功能意义。

这种范式的治疗潜力通过表观遗传预适应策略得到例证，其中初始的染色质重塑有助于后续高效的基因编辑。此外，将CRISPR系统与药理学表观遗传调节剂相结合代表了一种有前景的转化方法。

要推进这些技术，必须解决几个关键挑战。CRISPR安装的表观遗传标记的持久性仍然不确定，因为编辑状态可能通过细胞分裂被稀释或被内源性酶活性逆转。体内编辑组分的有效递送，特别是对于组合方法，是另一个主要障碍。安全性考虑，包括脱靶效应和免疫反应，在复杂的编辑方案中被放大。此外，调控回路的情境依赖性本质需要对组织和细胞类型进行特异性优化。

未来的研究应优先考虑纵向追踪表观遗传记忆的持久性、回路动力学的单细胞分析，以及开发能够使用多组学数据模拟回路行为的下一代算法。解决这些挑战将加速CRISPR-表观遗传技术向精准医学应用的转化，同时完善我们对健康和疾病中基因调控的基本理解。