利用基因枪递送Cas9 RNP和瞬时表达构建体高效生产基因编辑洋葱植株

《Plant Cell Reports》：Efficient production of gene-edited onion (Allium cepa) plants using biolistic delivery of cas9 RNPs and transient expression constructs

本研究针对洋葱基因编辑效率低的问题，开发了一种基于CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合物（RNP）和瞬时表达技术的非稳定转化编辑体系。通过将Cas9/sgRNA RNP与形态发生调节基因或抗生素抗性基因载体共递送至洋葱未成熟胚，结合48小时潮霉素瞬时筛选，使编辑植株获得率提升至12.7%。该技术成功获得47株AcDMR6基因编辑植株，为无外源DNA残留的作物育种提供了新策略。

　　

洋葱作为全球重要的蔬菜作物，其育种进程却长期受制于遗传转化效率低下的瓶颈。传统转基因方法不仅耗时耗力，更会导致外源基因残留，给食品安全和环境安全带来隐患。随着CRISPR基因编辑技术的兴起，科学家们开始探索无需稳定转化的编辑策略，其中核糖核蛋白复合物（RNP）递送因其可避免外源DNA整合而备受关注。然而在洋葱中，由于缺乏高效的原生质体再生体系，RNP技术的应用一直难以突破。

为解决这一难题，威斯康星大学麦迪逊分校的研究团队创新性地将瞬时表达策略与RNP编辑技术相结合。他们以洋葱抗病关键基因AcDMR6（Downy Mildew Resistant 6）为靶点，通过基因枪共递送Cas9/sgRNA RNP与含有发育调节基因或抗生素抗性基因的瞬时表达载体，建立了一套高效的洋葱基因编辑体系。这项突破性研究成果发表在植物学领域权威期刊《Plant Cell Reports》上，为无转基因作物育种提供了重要技术支撑。

研究团队采用了几项关键技术方法：首先通过原生质体瞬时编辑实验筛选出编辑效率达68%的AcDMR6-sgRNA1；利用基因枪技术将RNP复合物与pStayGold荧光报告载体共递送至洋葱组织；建立基于未成熟胚的植株再生体系，并创新性地采用48小时潮霉素瞬时筛选策略；通过限制性内切酶分析、Sanger测序和扩增子测序等多种方法鉴定编辑基因型。

材料与方法

研究使用"Char-Syn"合成洋葱种群，从未成熟胚中提取2.5-3.5 mm大小的胚胎作为实验材料。通过生物导弹技术递送RNP复合物，并采用包含恢复培养基、P5培养基和SM4培养基的分阶段组织培养流程实现植株再生。

结果

高效sgRNA的筛选

研究人员设计了4个靶向AcDMR6基因不同外显子的sgRNA，通过原生质体瞬时编辑实验发现sgRNA-1的编辑效率最高，达到68%，因此选择该sgRNA进行后续实验。

通过粒子轰击递送Cas9/sgRNA RNP

实验证实通过基因枪递送的RNP复合物能够在洋葱组织中实现有效编辑，在胚根组织中检测到1.32%-2.70%的编辑效率。

发育调节基因表达富集基因编辑

当单独使用RNP处理时，146株再生植株中未检测到编辑事件。而共递送发育调节基因载体（pGRF-GIF、pBBM、pWUS2）后，编辑植株获得率提升至1.7%-3.1%，表明瞬时表达发育调节基因可有效富集编辑事件。

瞬时潮霉素筛选富集基因编辑

结合潮霉素抗性基因（pHyg）与发育调节基因的共递送策略，使编辑植株获得率显著提高至12.7%。48小时潮霉素处理能有效抑制未转化细胞的生长，从而富集经RNP编辑的细胞。

胚胎愈伤组织中的瞬时潮霉素筛选

以18日龄胚胎愈伤组织为材料进行编辑，获得5.8%-6.4%的编辑效率，证明该策略在不同类型外植体中均适用。

编辑株系的基因型特征

在获得的47株编辑植株中，28%为纯合突变，25%为双等位基因突变，15%为杂合突变，32%为嵌合体。超过半数的植株无需后代分离即可直接进行表型研究。

讨论与结论

该研究首次建立了洋葱中基于RNP的高效基因编辑平台，创新性地利用瞬时表达策略成功解决了非转化编辑体系中编辑细胞难以富集的关键难题。通过发育调节基因的瞬时表达可促进受编辑细胞优先进入再生途径，而瞬时抗生素筛选则能有效淘汰未转化细胞，两种策略的协同使用使编辑效率得到显著提升。

特别值得关注的是，绝大多数编辑植株中未检测到功能性的外源基因稳定整合，证明瞬时表达足以实现编辑富集，这为获得无转基因编辑作物提供了技术保障。研究中观察到的体细胞克隆现象（约22%的编辑事件可产生多个基因型相同的植株）为快速获得大量编辑材料提供了便利。

该技术体系的建立不仅解决了洋葱基因编辑的技术瓶颈，更为其他难以转化的作物物种提供了可借鉴的通用策略。所获得的AcDMR6基因编辑洋葱植株为研究该基因在洋葱抗病性中的作用提供了宝贵材料，有望为洋葱病害防控开辟新途径。这项研究标志着作物基因编辑技术向更安全、更高效的方向迈出了重要一步，对推动现代农业生物技术发展具有深远意义。