日粮净能与纤维降解酶对生长育肥猪生长性能及肠道菌群的调控作用研究

《Journal of Applied Animal Research》：Effects of dietary net energy and fibre-degrading enzymes on growth performance and gut microbiota in growing-finishing pigs

本文通过2×2因子设计，探讨了降低日粮净能（NE）40 kcal/kg并添加纤维降解酶对生长育肥猪的影响。研究发现，酶制剂通过提高酸洗纤维（ADF）消化率、增加粪便短链脂肪酸（SCFA）如乙酸和丁酸浓度，并富集有益菌群（如Akkermansia和Prevotellaceae UCG-001），部分缓解了低NE导致的平均日增重（ADG）下降，为通过营养策略降低养猪成本提供了理论依据。

　　

ABSTRACT

本研究旨在评估日粮净能（NE）水平和纤维降解酶对生长育肥猪生长性能、养分消化率、血清生化及炎症指标、粪便短链脂肪酸（SCFA）和微生物组成的综合影响。试验选取192头初始体重为69.40 ± 1.95 kg的杂交猪，采用2×2因子设计（高/低NE，添加/不添加酶），进行了为期35天的饲养试验。结果表明，降低NE水平导致平均日增重（ADG）下降，而添加纤维降解酶有提高ADG（P = 0.09）和显著提高酸洗纤维（ADF）消化率（P < 0.01）的趋势。低NE日粮或添加酶制剂均能降低血清尿素氮（BUN）浓度。酶制剂添加组猪只血清白细胞介素-1β（IL-1β）水平较低，而粪便中有益微生物（如Akkermansia和Prevotellaceae UCG-001）的相对丰度显著增加（P < 0.05），同时乙酸和丁酸浓度也更高（P < 0.05）。结论认为，纤维降解酶通过改善纤维利用率和调节肠道菌群，部分缓解了因日粮NE降低40 kcal/kg所引起的ADG下降，为降低猪肉生产成本提供了理论支持。

Introduction

饲料成本占猪肉生产总成本的60%–70%，因此及时调整饲料配方对保障高效动物生产至关重要。在猪日粮中，能量和蛋白质是主要成分，对饲料成本影响显著。生长育肥猪处于快速生长期，提供与其实际能量需求匹配的日粮能最大化降低成本并提高生产效率。降低饲料成本的一个有效途径是使用高纤维的低成本原料，如小麦和干酒糟及其可溶物（DDGS）。降低日粮能量水平通常会导致膳食纤维含量增加。膳食纤维因其持水性、溶解度和粘度等特性，能影响动物消化过程；适量时可由猪肠道菌群部分发酵产生短链脂肪酸（SCFA），发挥有益作用。适量纤维作为益生元，可选择性刺激有益菌定植和微生物代谢物分泌，协同增强肠道免疫防御和屏障功能。SCFA可在肝脏和肌肉组织中代谢，为动物提供能量。提高膳食纤维的消化率不仅能缓解高纤维导致的日粮能量下降，还可能增加SCFA产量，改善动物健康。酶制剂已被证明可通过破坏纤维结构、降低食糜粘度和提高微生物发酵效率来增加膳食纤维的消化率。因此，在猪日粮中使用高纤维原料时，常添加木聚糖酶和β-葡聚糖酶以节约成本或启用替代原料。这些酶能提高干物质（DM）、总能（GE）的消化率及纤维利用率。此外，在玉米-豆粕-DDGS日粮中添加木聚糖酶和纤维素酶能提高生长猪回肠养分和纤维的利用率。多酶复合物的添加还能通过改变肠道环境来提高日粮中非淀粉多糖（NSP）的消化率。无论是通过直接提高碳水化合物消化率还是间接改善肠道环境，添加纤维降解酶均被观察到能提高饲料消化效率。基于此，本研究假设日粮纤维降解酶可减轻降低日粮能量对生长育肥猪生长性能的不利影响。鉴于能量水平与酶添加之间相互作用的不确定性，本研究设计了2×2因子试验，探讨两种日粮能量水平下添加或不添加酶对生长育肥猪生长性能、养分消化率、血清生化及炎症因子、粪便SCFA和粪便微生物组成的影响。

Materials and methods

Animals, diets and experimental designs

试验选取192头约4月龄、初始体重（BW）为69.40 ± 1.95 kg的杂交阉公猪（杜洛克×[长白×大白]），根据初始体重和性别分为4组。试验采用2×2因子设计，主要因素为日粮能量（高和低，相差40 kcal/kg NE）和200 g/t酶制剂添加（添加或不添加），试验期35天。通过调整玉米与麸皮比例来降低日粮净能（NE），同时保持粗蛋白（CP）和标准回肠可消化（SID）氨基酸水平一致。每个处理组6个重复栏，每栏8头猪（4公4母）。猪栏配备塑料漏缝地板、自动不锈钢乳头饮水器和料槽。所有猪只均按猪场标准程序管理。所用纤维降解酶为多酶复合物（ALLZYME SSF），按供应商推荐以200 g/t添加。该酶源于黑曲霉，通过增强的传统固态发酵法生产。测定了复合酶的活性，包括纤维素酶（164 CMCU/g）、β-葡聚糖酶（591 BGU/g）、木聚糖酶（326 XU/g）以及微量植酸酶、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶活性。试验日粮参照美国国家研究委员会（NRC）生长育肥猪营养标准配制。试验第0天，每栏采集500g饲料样品，按处理组混合后于4°C保存。分别于第1天和第35天测定个体体重和每栏采食量，计算平均日增重（ADG）、平均日采食量（ADFI）和料重比（F/G）。在第32-34天，每栏每日采集约300g粪便样品，于65°C烘箱干燥72小时后4°C保存待测。第34天，每栏选取一头体重接近栏平均值的猪进行前腔静脉采血。血液样本室温静置2小时后，于4°C以3000 × g离心15分钟，收集血清于-20°C保存。第35天，通过直肠按摩采集新鲜粪便样品（每栏1头，n=6），立即液氮冷冻后于-80°C保存用于SCFA和微生物组成分析。

Chemical analysis

饲料和粪便样品经1 mm筛均质。采用氧弹量热计测定GE。DM、CP、EE和OM的测定遵循AOAC方法。使用纤维分析仪和F57滤袋测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）。同时，根据ISO方法测定饲料和粪便中酸不溶灰分（AIA）含量，并作为内源指示剂计算养分消化率。使用全自动生化分析仪分析血清生化参数。使用商业ELISA试剂盒测定血清炎症因子浓度，包括IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-12、肿瘤坏死因子-γ（TNF-γ）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）。粪便SCFA浓度测定参考已有方法：称取0.5g粪便样品，加8mL超纯水匀浆，机械振荡后5000 × g离心15分钟；取上清与25%偏磷酸酸按比例混合，静置6小时；再次离心后经0.45μm滤膜过滤，使用气相色谱系统定量乙酸、丙酸、丁酸和戊酸浓度，载气为氮气。使用试剂盒提取粪便微生物基因组DNA，通过琼脂糖凝胶电泳和 spectrophotometer 检测DNA完整性和浓度。针对16S rRNA基因V3–V4高变区进行PCR扩增，引物为338F和806R。扩增产物纯化定量后进行下游测序。

Computational methods

根据Liu等方法，以AIA为内源指示剂计算GE、DM、OM、CP、NDF和ADF的表观全肠道消化率（ATTD）。计算公式为：ATTD (%) = 100 ? [（饲料中AIA浓度 × 粪便中养分浓度）/（粪便中AIA浓度 × 饲料中养分浓度）] × 100。

Statistical analysis

通过JMP 16.2的分布函数识别数据异常值。随后使用Fit Model程序进行交互分析，检验NE密度和纤维降解酶添加的主效应及其交互作用。通过普通最小二乘法计算处理均值，并采用Tukey检验进行多重比较。粪便微生物特征分析在Majorbio云平台进行。使用Ace和Shannon指数量化样本内微生物多样性（α多样性）。基于Bray–Curtis距离的主坐标分析（PCoA）可视化样本间群落差异（β多样性）。使用Wilcoxon秩和检验识别α多样性差异和组间差异微生物类群。P < 0.05认为差异显著，0.05 ≤ P < 0.10认为有趋势。

Results

Growth performance

生长性能结果显示，日粮NE与纤维降解酶之间无显著交互作用。饲喂高NE日粮的猪ADG和F:G显著优于低NE组。添加纤维降解酶有提高ADG的趋势。多重比较显示，LS组与HN组间生长性能无显著差异，但HS组ADG显著高于LN组。

Nutrition digestibility

养分消化率方面，日粮能量水平与酶制剂无显著交互作用。但多重比较显示，HS组ADF消化率显著高于LN组。降低日粮NE有降低GE和OM消化率的趋势。值得注意的是，添加纤维降解酶显著提高了ADF的消化率。

Serum biochemical indicators and inflammatory factors

在血清生化指标方面，观察到血清球蛋白（GLB）存在交互作用，但多重比较显示HN、HS、LN、LS组间无显著差异。高能组血清BUN浓度显著高于低能组。添加纤维降解酶降低了生长育肥猪的血清BUN。降低日粮能量对血清炎症因子浓度无影响，但添加酶制剂导致血清IL-1β含量较高，IL-2也有升高趋势。四组间比较显示，血清BUN和TNF-α存在差异，HN组猪血清BUN高于LS组。

Faecal short-chain fatty acids

低NE组猪粪便中丁酸浓度显著高于高NE组。日粮添加纤维降解酶导致粪便中乙酸和丁酸浓度升高，丙酸和戊酸浓度也有升高趋势。未检测到显著交互作用。然而，四处理组比较显示，LS组猪粪便中乙酸和丁酸浓度显著高于HN组。

Faecal microbial composition

粪便微生物组成和结构分析显示，四处理组间Ace和Shannon指数无差异。基于Bray–Curtis距离的PCoA显示组间聚类模式重叠，群落结构相似。Venn图展示了各处理间共有和独特的细菌ASV，属水平组成未见明显差异。然而，微生物群落比较分析显示，四处理间Akkermansia、Quinella、Butyrivibrio和Paludicola的相对丰度存在差异。具体而言，HS和LS组中Akkermansia、Quinella和Paludicola的比例显著高于HN和LN组。高能日粮（HE）和低能日粮（LE）组间微生物组成未见显著聚类，而未添加酶（NFE）与添加酶（FE）日粮组间观察到显著聚类。属水平微生物分析表明，较低日粮能量水平导致Lachnoclostridium和UCG-001相对丰度较高，而Erysipelotrichaceae_UCG-002丰度较低。进一步的LEfSe分析显示，添加膳食纤维降解酶后，Prevotellaceae_UCG-001、Verrucomicrobiales和Akkermansia的种群丰度较高。相反，Blautia、Ruminococcus_gauvreauii_group、Eubacterium_eligens_group、Slackia和Lachnospiraceae_NK3A20_group的相对丰度较低。

Discussion

净能（NE）计算涉及从代谢能（ME）中减去热增耗和发酵热，因此NE系统被认为是饲料配制最精确、最经济的方法。本研究所有日粮均基于NE系统配制，低能日粮NE比高能日粮低40 kcal/kg。降低日粮NE的策略主要出于动物生产中对饲料成本的考虑。然而，降低NE 40 kcal/kg会导致日粮纤维含量增加，因为使用了麸皮替代部分玉米和豆粕。本研究中，日粮能量水平影响生长育肥猪的生长性能，NE降低40 kcal导致ADG下降和F:G增加。此结果可能与日粮能量降低和纤维含量升高有关。过量膳食纤维会降低采食量、抑制消化酶活性，从而降低养分利用效率。为抵消这些不利影响，通常需要在日粮中补充适量活性酶。有趣的是，先前研究表明，当日粮NE水平分别为2,366、2,462和2,557 kcal/kg时，体重低于20kg的猪生长性能不受影响。这可能是因为体重较小的断奶仔猪，日粮NE水平不影响采食量，采食量可能受氨基酸（AA）平衡等营养需求驱动。相反，生长育肥猪可通过增加ADFI来部分补偿日粮NE水平的挑战，从而减轻对ADG的负面影响。但在本研究中，降低日粮NE 40 kcal并未显著影响ADFI。因此，有必要进一步研究扩大日粮NE水平范围对生长育肥猪生长性能的影响。日粮添加纤维降解酶使生长育肥猪ADG有升高趋势，这与以往关于添加NSP酶的研究结果一致。NSP降解酶有助于消化日粮中的NSP，从而提高养分消化率和改善生长性能。这体现在本研究中酶制剂组具有较高的ADF消化率。此外，HS组观察到最高的ADG，表明纤维降解酶在高低能量日粮中均能支持生长性能。本研究中，降低日粮NE有降低GE和OM消化率的趋势，但对DM、CP、NDF和ADF的ATTD无影响。这些结果与部分研究报道一致。低NE日粮导致的GE和OM消化率下降可能与日粮中膳食纤维水平不同有关。膳食纤维可能通过缩短食糜在胃肠道内的停留时间而降低养分消化率。抵消膳食纤维影响常通过加工技术或添加特定酶来实现。一些研究表明，日粮添加纤维降解酶可提高猪的NDF或ADF消化率。本研究中，无论在标准还是低能日粮中，添加纤维降解酶均提高了ADF消化率，证明其有效性不受日粮纤维水平影响。血清生化参数是评估动物全身健康和代谢稳态的关键生物标志物，是评价饲料应用效果的重要指标。本研究中，降低日粮NE和添加纤维降解酶均导致血清BUN降低。血清BUN作为蛋白质分解的代谢产物，是蛋白质利用的关键指标，在AA和氮摄入平衡中起重要作用。较低的血清BUN与改善的氮利用相关，通常导致剩余养分排泄减少，从而降低粪便和尿液中的有机物。类似地，添加纤维降解酶可能通过分解膳食纤维，延长食糜停留时间，从而增强氮的吸收和利用。IL-1β是一种促炎细胞因子，其体内水平升高通常表明存在炎症反应。有研究表明，微生物来源的丁酸通过调节细胞分化影响肠道免疫。本研究中，添加纤维降解酶后，丁酸产生菌群和粪便丁酸浓度较高。这些发现表明，纤维降解酶通过增强肠道微生物组产生丁酸，进而减轻炎症。SCFA是肠道微生物群厌氧发酵膳食纤维和其他不可消化碳水化合物产生的代谢产物。SCFA的产生与肠道微生物群结构和功能密切相关，并显著受膳食成分影响，尤其是膳食纤维摄入在塑造肠道微生物组成中起关键作用。因此，高纤维日粮通常促进SCFA产量增加，而低纤维日粮可能导致SCFA浓度降低。本研究中，低NE组（高膳食纤维）粪便丁酸浓度较高。粪便SCFA浓度的这些变化与粪便微生物组成的变化相关。与本结果一致，先前研究表明膳食纤维摄入增加了Lachnoclostridium的相对丰度。Lachnoclostridium作为毛螺菌科成员，因其能通过发酵纤维二糖和果胶产生乙酸和丁酸，被认为是一种潜在有益菌。低NE组粪便丁酸浓度升高可能源于Lachnoclostridium相对丰度的增加。值得注意的是，日粮添加纤维降解酶导致生长育肥猪粪便乙酸和丁酸浓度更高。乙酸是宿主的重要能量来源，约提供总能量的10%，而丁酸在减轻炎症和增强免疫功能方面起关键作用。重要的是，主效应分析显示，饲喂纤维降解酶的猪粪便中Akkermansia的相对丰度更高。Akkermansia以其抗炎特性而闻名，这可能是添加酶制剂后观察到血清IL-1β浓度较低的原因。先前研究证明了肠道内产甲烷菌的丰度与纤维素降解能力之间存在密切联系。Prevotellaceae家族因其能有效利用膳食纤维从日粮中提取能量而闻名，并能增加葡萄糖代谢。这一发现表明，在纤维降解酶作用后，纤维更容易被肠道微生物群（如Prevotellaceae UCG?001）利用，从而提高了ADF的消化率。

Conclusions

在生长育肥猪日粮中降低NE 40 kcal/kg所导致的ADG下降，可通过使用纤维降解酶得到部分缓解。我们推测，较高的膳食纤维消化率使其更易被有益微生物（如Akkermansia和Prevotellaceae UCG-001）利用，产生乙酸和丁酸，从而增强猪的免疫功能和生长性能。总之，本研究为生产中的降本策略提供了支持，表明当配以适当的酶制剂时，降低NE水平是一种经济可行的方法。