基于噬菌体SapYZU01与CuCo2S4纳米酶联用的比色传感平台用于食品中活态金黄色葡萄球菌的快速灵敏检测

针对食品中金黄色葡萄球菌(S. aureus)污染快速检测难题，本研究构建了噬菌体SapYZU01与CuCo2S4纳米酶联用的比色生物传感器。该系统可在14分钟内完成检测，检测限达78 CFU/mL，具备优异的选择性、抗干扰性和活菌识别能力，为食品安全监测提供了高效可靠的新技术。

　　

金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种重要的食源性病原体，可引起严重的食物中毒和感染性疾病，对人类健康和全球食品安全构成严重威胁。该菌在食品生产、加工、运输和分销过程中极易污染乳制品、蛋类和禽肉等产品，且具有高度传染性和顽强生存能力，能在7°C至48.5°C的温度范围和pH 4.2至9.3的环境中存活。更令人担忧的是，活的金黄色葡萄球菌可分泌多种毒力因子，包括约33种葡萄球菌肠毒素（SEs）和类SE毒素，其中许多通过水平基因转移在活菌间传播。然而，早期检测金黄色葡萄球菌污染仍面临显著挑战，导致健康和安全问题频发。因此，开发一种快速、灵敏、准确的现场检测方法用于食品样品中活金黄色葡萄球菌的检测显得尤为迫切。

纳米酶比色检测平台因其现场可视性、高催化活性、强稳定性、成本效益以及纳米材料的独特特性，为细菌检测提供了高效途径。其中，CuCo₂S₄纳米酶因其成本低、储量丰富和环境友好性而备受关注。然而，纳米酶比色生物传感器的选择性通常依赖于生物识别元件，如抗体、适配体、酶和多肽，但这些元件对极端pH和温度波动敏感，且固定化过程复杂。相比之下，噬菌体作为天然病毒捕食者，对目标生物表现出卓越的特异性，且比抗体、适配体等更易制备、成本更低，对极端条件耐受性更强，因此是理想的生物识别剂。尽管如此，单一噬菌体的宿主范围较窄，需选择广宿主范围噬菌体或构建靶向多菌株的噬菌体鸡尾酒以提高检测广度。

在此背景下，研究人员从废水中分离出一株金黄色葡萄球菌裂解噬菌体SapYZU01，并分析了其一步生长曲线、宿主范围、pH稳定性和温度稳定性等生物学特性。基于该噬菌体与CuCo₂S₄纳米酶，开发了一种比色生物传感器，用于食品样品中金黄色葡萄球菌的快速灵敏检测。该研究旨在探究纳米酶的催化机制和生物传感器的检测机制，以及噬菌体与金黄色葡萄球菌的相互作用。

研究采用水热法合成CuCo₂S₄纳米酶，并通过碳二亚胺交联法将噬菌体SapYZU01与纳米酶偶联，形成SapYZU01@CuCo₂S₄复合物。利用透射电子显微镜（TEM）、X射线衍射（XRD）、X射线光电子能谱（XPS）等技术对材料进行表征；通过稳态动力学评估其过氧化物酶样活性；使用电子顺磁共振（EPR）和自由基清除实验分析催化机制；通过吸附率测定和基因组测序探讨噬菌体的识别机制；最后在即食食品样品中进行应用验证，评估其实际检测能力。

研究结果显示，噬菌体SapYZU01属于短尾噬菌体科（Podoviridae），头部呈二十面体结构（直径约50 nm），最佳感染复数（MOI）为0.1，滴度达7.89×10⁸ PFU/mL，在pH 3-12和温度高达70°C的条件下均表现出良好稳定性。一步生长曲线显示其潜伏期为20分钟，裂解量为40.26±0.28 PFU/细胞，对85株金黄色葡萄球菌分离株中的60株（70.59%）具有裂解能力，包括所有5株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）和55株甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）。

CuCo₂S₄纳米酶呈不规则三维纳米颗粒结构，XRD和XPS分析证实其成功合成且元素分布均匀。SapYZU01@CuCo₂S₄复合物中噬菌体头部牢固附着于纳米材料，并保持生物活性，能特异性结合金黄色葡萄球菌。稳态动力学表明，该复合物对H₂O₂和TMB的K_m值分别为0.96 mM和5.15 mM，V_max值分别为5.53×10^?8 M/s和17.08×10^?8 M/s，显示出优异的过氧化物酶样活性和底物亲和力。

优化后的检测条件为pH 4.0、温度40°C、TMB和H₂O₂浓度均为12 mM、SapYZU01@CuCo₂S₄用量66 μL、孵育时间2分钟、反应时间12分钟，总检测时间仅14分钟。该系统对金黄色葡萄球菌的线性检测范围为1×10²–1×10⁷ CFU/mL，检测限为78 CFU/mL，且具有良好的选择性、抗干扰性和存储稳定性（30天内酶活性保持稳定）。此外，该系统能特异性识别活菌，对死菌无响应，因死菌的壁磷壁酸（WTA）被破坏无法被噬菌体识别。

机制研究表明，SapYZU01@CuCo₂S₄催化体系通过产生羟基自由基（·OH）、超氧阴离子自由基（O₂^•–）和单线态氧（¹O₂）驱动显色反应，其中·OH起主要作用。金黄色葡萄球菌通过阻塞纳米酶活性位点抑制·OH生成，从而减少oxTMB形成导致颜色变浅。噬菌体识别机制涉及其受体结合蛋白（RBP）与金黄色葡萄球菌壁磷壁酸（WTA）的特异性结合，其中TarS、TarM和TarP三种糖基化WTA类型均被识别，基因组分析显示SapYZU01携带DNA聚合酶、包装蛋白、溶菌酶和尾纤维蛋白等基因，赋予其高效复制和宿主裂解能力。

在实际应用方面，SapYZU01@CuCo₂S₄在五种即食食品（红烧土豆牛肉、照烧鸡肉、炒猪肉、香菇蒸鸭和黑胡椒牛肉）中检测金黄色葡萄球菌的回收率达90.16%–114.29%，且不受食品添加剂、NaCl和pH变化的影响，表明其在复杂食品基质中具备可靠检测能力。

该研究成功开发了一种基于噬菌体和纳米酶的比色生物传感器，用于食品中活金黄色葡萄球菌的快速、灵敏、特异性检测。该系统检测时间短（14分钟）、检测限低（78 CFU/mL）、抗干扰性强，且能区分活死菌，克服了传统方法的局限性。机制上，金黄色葡萄球菌通过阻塞纳米酶活性位点抑制·OH产生，而噬菌体通过RBP与WTA的特异性结合实现精准识别。研究成果为食品安全监测提供了高效、经济、可靠的技术手段，对保障公众健康和促进食品工业发展具有重要意义。论文发表于《LWT》期刊，展现了该技术在食品安全领域的广阔应用前景。