BRIGHT系统：通过二价近红外纳米抗体介导的级联照明实现非重复序列的高信噪比活细胞成像

《Advanced Science》：BRIGHT Enables High-SNR Live-Cell Imaging of Non-Repetitive Sequences via Bivalent Fluorescent Nanobody-Mediated Cascade-Dependent Illumination

本文报道了一种名为BRIGHT的创新活细胞成像系统，该系统通过dCas9-n×ALFA靶向基因组位点，并利用靶向ALFA标签的二价近红外荧光纳米抗体（Bi-NIR-FbALFA）的二价结合和抗原依赖性照明特性，触发级联依赖性照明，从而显著提升非重复序列成像的信噪比（SNR）。研究表明，BRIGHT在端粒标记中的SNR比SunTag和PP7-PCP系统分别提高约6.26倍和6.76倍，并能实现SNR高达284.84的非重复DNA成像。此外，BRIGHT可媲美现有工具追踪染色质动力学，将动态与核定位同转录活性相关联，并能检测染色体外环状DNA（eccDNA）的分布和动态异质性。该系统为研究基因组动力学和基因调控提供了强大工具。

　　

摘要

基因组位点和基因组非依赖性DNA表现出与生理功能相关的异质性动力学。非重复序列的活细胞成像至关重要，但受到低信噪比（SNR）的限制，影响了精确识别和动态追踪。本研究报道了BRIGHT（Bivalent near-infrared nanobody-mediated cascade illumination of genomic loci for high-SNR tracking）系统的开发，用于非重复序列的活细胞成像。BRIGHT采用dCas9-n×ALFA靶向基因组位点，并通过二价结合以及靶向ALFA标签的二价近红外荧光纳米抗体（Bi-NIR-Fb_ALFA）的抗原依赖性照明触发级联依赖性照明，从而实现高SNR。BRIGHT在端粒标记中实现的SNR比SunTag和PP7-PCP系统分别高约6.26倍和约6.76倍，并能实现SNR高达284.84的非重复DNA成像。此外，BRIGHT在追踪染色质动力学方面与先前工具表现相当，能将动力学和核定位与转录活性联系起来，并能检测染色体外环状DNA（eccDNA）的分布和动态异质性。总体而言，BRIGHT显著提高了非重复序列成像的SNR，为研究基因组动力学和基因调控提供了一种创新工具。

1 引言

基因组位点以及基因组非依赖性DNA元件（如病毒DNA和染色体外环状DNA（eccDNA））的活细胞成像对于理解细胞功能和疾病机制至关重要。早期的荧光工具利用大型整合DNA阵列或工程化DNA结合蛋白，但常常破坏天然靶标功能并带来技术挑战。

近年来，成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白9（CRISPR-dCas9）已被应用于DNA成像。通常，在特定基因座检测到信号需要150-200个荧光分子，这促使了各种线性信号放大策略的发展，用于标记重复序列。然而，非重复序列的成像仍然是一个关键目标，因为它们约占人类基因组的40-50%，并且对核心生物过程至关重要。虽然非重复序列成像已经实现，但其信噪比（SNR）对于精确追踪而言仍然不足。高SNR成像的关键在于信号放大和背景去噪。信号放大策略如CRISPR tiling和强级联放大允许非重复序列成像，但由于“常亮”荧光蛋白（FPs）的背景，SNR仍低于30。背景去噪策略旨在降低未结合荧光团的强度或数量，但使用线性放大的非重复序列成像产生的信号有限。因此，当前的方法尚未在非重复序列标记中同时实现用于高信号的强级联放大和用于低噪声的有效背景去噪。

在此，我们提出了一种活细胞成像系统BRIGHT（bivalent near-infrared nanobody-mediated cascade illumination of genomic loci for high-SNR tracking），允许对非重复序列进行稳健的可视化。该策略基于最近开发的双特异性且抗原依赖性的近红外荧光纳米抗体（NIR-Fb），后者高度不稳定，会被泛素-蛋白酶体系统自我降解，除非其两个抗原结合臂都饱和。基于此设计，我们设计了一种靶向两个相同的13个氨基酸ALFA标签的二价NIR-Fb（Bi-NIR-Fb_ALFA）。当dCas9与串联的ALFA标签（dCas9-n×ALFA）融合时，它可以招募多个Bi-NIR-Fb_ALFA到DNA靶标，其双价结合进一步与额外的dCas9-n×ALFA发生交联，形成多层组装体，从而驱动NIR信号的级联放大。此外，抗原依赖性照明特性确保只有与两个ALFA标签饱和结合的Bi-NIR-Fb_ALFA才保持荧光，有效抑制背景并将荧光特异性地限制在靶标基因座。总体而言，级联放大和背景去噪共同促成了BRIGHT系统中非重复序列的高SNR成像。

2 结果

2.1 BRIGHT成像系统的设计

为了实现非重复序列的高SNR成像，我们开发了BRIGHT系统，该系统包含dCas9-n×ALFA融合蛋白、sgRNA和Bi-NIR-Fb_ALFA。Bi-NIR-Fb_ALFA通过两个关键功能在高SNR中发挥核心作用：1）充当“两只手”来聚集两个dCas9-n×ALFA拷贝；2）充当“灯泡”，在对接入特定的“插座”——ALFA标签之前保持暗状态。BRIGHT系统的成像机制依赖于级联放大和信号去噪。在sgRNA的引导下，dCas9-n×ALFA特异且稳定地结合其DNA靶标，建立锚定层并招募Bi-NIR-Fb_ALFA。凭借两个抗原结合臂，Bi-NIR-Fb_ALFA可以通过高亲和力的抗原-抗体相互作用，招募额外的游离dCas9-n×ALFA朝向锚定层。Bi-NIR-Fb_ALFA和dCas9-n×ALFA在靶位点的级联组装驱动了局部NIR积累，导致强烈的信号放大。同时，ALFA未饱和的Bi-NIR-Fb_ALFA通过其抗原依赖性稳定化作用被快速降解，从而实现最小的背景。

2.2 Bi-NIR-Fb_ALFA成像功能验证

作为高SNR成像的关键，我们首先确认了Bi-NIR-Fb_ALFA的两个基本特性。为了评估抗原依赖性照明，我们将CMV驱动的Bi-NIR-Fb_ALFA与dCas9-24×ALFA或dCas9-24×GCN4共转染到HEK293T细胞中。仅在存在ALFA标签时观察到强烈的NIR荧光，这表明ALFA标签保护Bi-NIR-Fb_ALFA免受蛋白酶体降解，而不相关的GCN4标签则不能提供这种稳定作用。此外，我们观察到核内NIR凝聚体，这可能被误解为特异性信号，这可能是由于CMV驱动的高表达导致与dCas9-24×ALFA发生不依赖于DNA靶标的交联。因此，我们优化了启动子以获得适当的Bi-NIR-Fb_ALFA表达。我们测试了三个启动子，包括EF-1α（中等）、hPGK（中等）和miniCMV（弱）。mRNA和NIR荧光水平一致表明CMV启动子的表达最高，其次是EF-1α、hPGK和miniCMV。hPGK启动子被确定为最佳选择，能产生相对较低的荧光，且不形成凝聚体或核仁富集。

为了验证双价结合介导的级联放大，我们构建了抗原依赖性NIR-Fb_ALFA的单价版本（Mo-NIR-Fb_ALFA），并比较了其与Bi-NIR-Fb_ALFA在端粒（一个经典的转录沉默异染色质位点）的标记性能。由于其单价性质，Mo-NIR-Fb_ALFA实现线性放大，而Bi-NIR-Fb_ALFA形成级联组装以增强NIR荧光。正如预期，使用Bi-NIR-Fb_ALFA进行端粒标记产生了清晰且更亮的NIR点，其平均荧光强度比Mo-NIR-Fb_ALFA增强了约2.51倍，这可归因于其双价结合能力，因为两种构建体都携带两个miRFP670nano3分子。

2.3 BRIGHT实现重复基因组位点的高SNR成像

为了探索BRIGHT的成像性能，我们在HEK293T细胞中比较了BRIGHT介导的端粒标记与基于线性放大的成像系统，包括SunTag和PP7-PCP系统。BRIGHT在细胞核内产生了均匀的端粒样NIR信号，背景极低，而仅表达两个BRIGHT组分的阴性对照组以及Bi-NIR-Fb_ALFA与dCas9-24×ALFA和sgGAL4（在人细胞中缺乏靶标）共表达的组则没有显示任何信号。这些结果表明BRIGHT标记需要所有三个组分，并且优先发生在dCas9靶向的DNA位点。我们详细阐述了这种选择性的潜在机制如下：一旦被sgRNA引导，dCas9-n×ALFA/sgRNA稳定地结合靶DNA，为Bi-NIR-Fb_ALFA介导的级联交联提供了一个稳定的成核位点。相比之下，dCas9-n×ALFA/sgRNA复合物在非靶DNA上的停留时间少于1秒，而游离的dCas9-n×ALFA和Bi-NIR-Fb_ALFA在低浓度下保持高度动态和自由扩散，并通过随机扩散和碰撞相互作用，阻止了稳定的级联NIR凝聚体形成。BRIGHT实现了最大SNR为154.96，其平均SNR分别比SunTag和PP7-PCP高约6.26倍和约6.76倍。为了检验其标记效率，我们量化了BRIGHT识别出的端粒数量，平均每个细胞产生49.48 ± 20.61个点，与PP7-PCP获得的结果相当。总体而言，BRIGHT在SNR方面优于两个系统，同时保持了相当的标记效率。

我们接下来探究BRIGHT是否能标记端粒以外的多种重复基因组位点。将HEK293T细胞转染dCas9-24×ALFA、Bi-NIR-Fb_ALFA和靶向3号染色体、13号染色体高拷贝位点以及MUC4基因外显子2的sgRNAs。所有测试的位点都被成功标记，显示出清晰的NIR点，与它们在HEK293T细胞中的拷贝数一致。

为了进一步表征BRIGHT的内在特性，选择Chr3Rep作为代表性靶标。我们进行了延时成像以监测BRIGHT的时间动态。成像分析显示，NIR焦点在转染后6小时即出现，并随时间推移在HEK293T细胞中逐渐增大和增强。值得注意的是，在持续追踪长达72小时期间，这些焦点几乎保持不变，证明了BRIGHT的高时间稳定性。长期连续追踪引发了对细胞功能潜在光毒性影响的担忧。为了评估这一点，我们监测了活性氧（ROS）的产生，这是光毒性的早期敏感标志物。在连续激发15个单光学切片（间隔5秒）期间，与阴性对照相比，BRIGHT标记的细胞仅表现出轻微的ROS增加，表明光毒性较低。这可能得益于使用NIR荧光蛋白miRFP670nano3，这与报道称NIR激发能最小化活细胞光毒性的结果一致。

我们随后进行了荧光漂白后恢复（FRAP）实验以确定BRIGHT组分的结合动力学。在FRAP实验中，使用640纳米激光在33%功率下对感兴趣区域（ROIs）进行0.12-0.24秒的漂白，并在漂白后每3秒监测荧光恢复，持续180秒。在这些条件下，漂白的BRIGHT点显示出可忽略的恢复，表明结合和游离的Bi-NIR-Fb_ALFA之间交换极少，这可能是由于Bi-NIR-Fb_ALFA在级联放大复合物中的稳定结合以及大量未结合Bi-NIR-Fb_ALFA的降解所致。这种稳定结合可能解释了为什么在持续追踪长达72小时期间仍能观察到BRIGHT点，这可能对研究细胞周期依赖性或分化相关的染色质动力学，以及在单细胞水平追踪病毒核内事件具有重要意义。值得注意的是，结合和游离Bi-NIR-Fb_ALFA之间的极少交换可能会限制高频追踪，因为标记基因座的漂白无法通过扩散分子有效补充。因此，降低曝光强度和时间可能有助于缓解这种效应。

我们接下来通过使用dCas9-24×ALFA和Bi-NIR-Fb_ALFA靶向HEK293T细胞中的Chr3Rep来评估BRIGHT标记的SNR。利用Bi-NIR-Fb_ALFA的双价结合和抗原依赖性照明，BRIGHT实现了211.23 ± 104.46的高SNR。为了剖析每个功能的贡献，我们构建了缺乏这两个功能的“常亮”Mo-NIR-Fb_ALFA，以及保留双价结合但缺乏抗原依赖性照明的“常亮”Bi-NIR-Fb_ALFA。然后我们用dCas9-24×ALFA和这两种“常亮”纳米抗体在HEK293T细胞中标记Chr3Rep，得到的SNR分别为16.13 ± 2.46和53.29 ± 9.26，表明双价结合带来了约3.38倍的增强。通过比较“常亮”和抗原依赖性Bi-NIR-Fb_ALFA的SNR，评估了抗原依赖性照明的贡献，导致约4.08倍的增加。这些结果表明双价结合和抗原依赖性照明在SNR增强中都起着重要作用。

为了量化级联复合物中Bi-NIR-Fb_ALFA在dCas9-24×ALFA上的占据率，我们设计了一个正交的BRIGHT/PP7-PCP策略，形成dCas9-24×ALFA/Bi-NIR-Fb_ALFA/2×PP7-sgChr3Rep/PCP-3×GFP复合物，并能够从miRFP670nano3/GFP荧光强度比估计Bi-NIR-Fb_ALFA占据率。比率经过双重归一化以校正内在FP强度差异和分子化学计量。平均占据数为每个dCas9-24×ALFA上有8.78 ± 1.60个Bi-NIR-Fb_ALFA（36.58%占据率）。考虑到PCP-3×GFP结合并非100%有效，实际占据率更高。

2.4 BRIGHT实现内源性和外源性非重复序列的高SNR可视化

为了实现可视化非重复序列的最终目标，我们应用dCas9-24×ALFA和Bi-NIR-Fb_ALFA来标记MUC4基因内的非重复MUC4.1位点。转染了BRIGHT组分的HEK293T细胞显示出清晰的NIR MUC4.1信号，而使用sgGAL4则未观察到点，证明成功可视化了一个非重复序列。

我们随后优化了非重复序列可视化的条件。首先，我们评估了dCas9融合不同数量ALFA标签（dCas9-1×, 4×, 8×, 16×, 或24×ALFA）使用Bi-NIR-Fb_ALFA的标记性能。可检测的MUC4.1信号仅出现在dCas9-16×ALFA和dCas9-24×ALFA。用dCas9-16×ALFA标记的MUC4.1产生的点明显更小，而两种构建体显示出相似的高SNR。我们然后使用正交策略量化了Bi-NIR-Fb_ALFA在dCas9-16×ALFA上的占据率，得到至少7.85 ± 1.29个Bi-NIR-Fb_ALFA结合（49.1%占据率）。这与dCas9-24×ALFA上的Bi-NIR-Fb_ALFA占据率相当，表明增加超过16个ALFA重复序列并不会增强Bi-NIR-Fb_ALFA招募，可能是由于空间位阻饱和，这可以解释使用dCas9-16×ALFA和dCas9-24×ALFA标记MUC4.1时相似的SNR。接下来，我们测试了增加NIR-Fb_ALFA的价态是否能改善标记性能，构建了三价版本的NIR-Fb_ALFA（Tri-NIR-Fb_ALFA）。尽管Tri-NIR-Fb_ALFA与融合≥8×ALFA的dCas9能够标记MUC4.1，但其整体SNR显著低于Bi-NIR-Fb_ALFA，可能是由于其需要同时饱和三个结合臂，不完全结合可能导致局部降解和信号荧光减弱。因此，dCas9-16×ALFA与Bi-NIR-Fb_ALFA是标记非重复序列的首选。类似地，我们然后评估了Bi-NIR-Fb_ALFA的双价结合和抗原依赖性照明在非重复MUC4.1标记中使用dCas9-16×ALFA的贡献。“常亮”Mo-NIR-Fb_ALFA未产生可检测信号，而“常亮”Bi-NIR-Fb_ALFA能够以44.61 ± 13.27的SNR进行成像。抗原依赖性Bi-NIR-Fb_ALFA比“常亮”Bi-NIR-Fb_ALFA实现了约3.42倍的SNR增强。这些结果表明，双价结合介导的级联放大对于非重复序列成像是必不可少的，而抗原依赖性照明提供了额外的SNR增强。

我们随后研究了MUC4.1与Bi-NIR-Fb_ALFA/dCas9-16×ALFA的标记特异性和效率。在对MUC4.1进行活细胞成像后，将HEK293T细胞固定，进行靶向M4-E2Rep重复区域的寡核苷酸荧光原位杂交（oligo-FISH）。BRIGHT标记的MUC4.1点与FISH信号显示出清晰的共定位，证实了BRIGHT的高特异性。此外，我们经常观察到每个细胞有2-3个标记的MUC4.1点。这与报道的HEK293T细胞中MUC4基因的2-3个拷贝一致，支持了BRIGHT的高标记效率。

我们进一步探究BRIGHT是否适用于标记其他非重复序列以及在不同细胞系中的适用性。测试了HEK293T细胞中的另外五个非重复位点，包括MUC4基因内的MUC4.2、MUC4.3和MUC4.4，3号染色体上的PPP1R2和13号染色体上的SOX1。所有位点都被有效标记，显示出明亮的NIR点，背景极低。然后我们测试了BRIGHT在HeLa、HepG2和U2OS细胞系中标记MUC4.1的能力。点的数量与不同细胞类型中MUC4基因的拷贝数一致。在高度非整倍体的U2OS细胞中，观察到1-4个MUC4.1点，与之前的报道相符。因此，BRIGHT展示了广泛的适用性和多功能性。

此外，我们通过靶向整合在HeLa基因组中的高危人乳头瘤病毒18（HPV-18）来验证BRIGHT检测外源性非重复序列的能力，HPV-18是宫颈癌的主要原因。我们设计了一个靶向高度保守的L1区域的sgRNA，并确认了其在HeLa基因组中的存在。在HeLa细胞中转染BRIGHT产生了每个细胞4-49个焦点，与之前报道的HPV-18拷贝数一致。相比之下，使用sgGAL4对照未检测到焦点，证实了标记的特异性。

2.5 BRIGHT可为多色和正交基因组位点成像提供多样发射光谱

多色正交成像能够在同一细胞内同时可视化多个基因组位点，促进对其空间组织、动态行为和功能相互作用的研究。因此，我们探索了BRIGHT是否可以扩展到近红外（NIR）之外，并与其他成像方法正交结合用于多重检测。

由于BRIGHT的发射光谱取决于插入Bi-Fb_ALFA的N65/C66分裂位点的FP，我们测试了替代FP以拓宽其光谱范围，同时保留其抗原依赖性照明和双价结合特性。候选FP应满足四个标准：1）在哺乳动物细胞中稳定表达；2）不需要外源辅因子；3）严格单体形式；4）小尺寸和紧凑结构。通过FPbase筛选，选择了单体12.6 kDa的青色荧光蛋白miniGFP1，并将其插入N65/C66位点，生成Bi-miniGFP1-Fb_ALFA。我们然后评估其抗原依赖性照明和双价结合特性是否保留。仅在存在ALFA标签时出现强烈的绿色荧光，与Bi-NIR-Fb_ALFA类似。并且在HEK293T细胞中标记Chr3Rep和MUC4.1时观察到明亮的绿色位点。因此，通过更换FP，可以在不同波长下调节BRIGHT荧光，同时保留其核心功能。

为了同时成像多个基因组位点，我们将BRIGHT与另一个基于CRISPR的系统结合使用。具体来说，我们使用Bi-NIR-Fb_ALFA/dCas9-16×ALFA标记MUC4.1，并使用嗜热链球菌dCas9融合3×GFP（St1 dCas9-3×GFP）以及St1 sgRNA靶向9号染色体着丝粒周围区域富集的GGAAT串联重复序列。我们观察到独立分布的NIR和绿色荧光点，证明了使用正交dCas9变体同时可视化不同基因组区域而无需成像系统间串扰的可行性。

2.6 BRIGHT允许可视化基因组位点动力学

追踪染色质动力学是揭示基因时空调控如何促成细胞功能事件的关键。我们探究BRIGHT是否能像先前开发的工具一样可视化染色质动力学。为了研究这一点，我们使用Bi-NIR-Fb_ALFA/dCas9-16×ALFA对Chr3Rep运动进行高频共聚焦成像（每帧0.2秒），并将其与先前报道的SunTag和PP7-PCP系统进行比较。我们分别在HEK293T细胞中表达靶向Chr3Rep的BRIGHT和这两个系统，并通过单粒子追踪和均方位移（MSD）分析运动。我们观察到标记焦点在约10秒时间尺度上具有相似的受限运动，具有可比的有效扩散系数（D_eff）。原始MSD数据中在较大时间滞后处的向下波动可能反映了统计伪影和生物异质性，主要是由于在较长滞后时间可用的轨迹数量减少和轨迹异质性，这是MSD分析中常见的不确定性来源。总之，BRIGHT在动态追踪中与传统CRISPR成像方法表现相当，其更高的SNR能够实现精确的信号定位。

2.7 BRIGHT将基因组位点的核定位和动力学与转录活性联系起来

基因的核定位和动力学与其转录活性相关。核纤层相关域（LADs）与核纤层相互作用并定位于核周边，通常是转录沉默且运动受限的。相比之下，非LADs位于中心位置，转录活跃且具有更大的流动性。鉴于这种关联，我们探索了BRIGHT在可视化LADs和非LADs核位置方面的适用性。基于ENCODE项目中HEK293T细胞的H3K9me3和H3K36me3修饰的染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据集，选择L3MBTL4基因（一个由H3K9me3标记的LAD相关位点）和RAB31基因（一个由H3K36me3标记的非LAD相关位点）作为代表性靶标。逆转录定量PCR（RT-qPCR）证实了RAB31的转录活性高于L3MBTL4，与ENCODE注释一致。然后我们标记这两个位点以可视化其核定位并追踪运动。测量了标记点到核周边的距离，并归一化至核直径以进行比较。与L3MBTL4对应的荧光信号显著更接近核周边。进行延时成像以追踪两个位点的时空动力学，发现RAB31在相同时间段内表现出比L3MBTL4更大的总轨迹长度和空间范围，反映了其更高的流动性和动态活性。这些发现证明了BRIGHT系统在将基因组位点的核位置和动力学与其转录活性联系起来方面的效用。

2.8 BRIGHT检测eccDNA并可视化其异质性

染色体外环状DNA（eccDNA）是一类独立于染色体基因组的环状DNA分子。由于缺乏着丝粒，eccDNA在 mitosis 期间经历不均匀分离，导致明显的细胞间拷贝数变异性，并进一步促进肿瘤内异质性。为了直接在活细胞中可视化这种异质性，我们应用BRIGHT进行eccDNA的高SNR成像。如前所述，eccBEND3存在于HepG2细胞中。我们从HepG2细胞中提取总eccDNA，并使用断点特异性PCR和Sanger测序验证了eccBEND3连接序列。选择该独特的、在亲本染色体DNA中不存在的连接序列用于BRIGHT标记。BRIGHT成像揭示了eccBEND3拷贝数的异质性，与早期观察一致。具体来说，与具有相对一致拷贝数的基因组位点不同，eccBEND3表现出显著的细胞间变异性，范围从每个细胞2到16个拷贝。除了拷贝数的高度变异性外，我们还观察到eccDNA的动态异质性。同一细胞内的三个特征性eccBEND3信号表现出不同的运动长度，点2显示出最明显的位置易位。此外，点1和点2显示受限扩散，而点3显示明显的间歇性跳跃。运动动力学的异质性，连同eccDNA拷贝数的变异性，塑造了一个复杂且异质的eccDNA生态系统，增强了肿瘤细胞在治疗压力下的适应性。BRIGHT能够直接可视化eccDNA异质性，为研究eccDNA行为和疾病机制提供了一种新工具。

3 讨论与结论

在此，我们报道了BRIGHT，一种用于非重复序列高SNR活细胞成像的新策略。BRIGHT利用Bi-NIR-Fb_ALFA的两个独特生化特性——双价结合能力和抗原依赖性照明——驱动的级联依赖性照明。通过串联ALFA标签和Bi-NIR-Fb_ALFA之间的多价交联实现高信号输出，同时通过未结合Bi-NIR-Fb_ALFA的自我降解将背景噪声降至最低。我们在整篇论文中通过实验证实了BRIGHT的机制。首先，我们证明了Bi-NIR-Fb_ALFA是特异性地ALFA依赖性的，并且其双价结合促进了级联复合物形成，在相同的荧光团化学计量下产生了比Mo-NIR-Fb_ALFA高约2.51倍的荧光强度。然后我们剖析了这两个功能对Chr3Rep处SNR增强的贡献，表明两者都起着重要作用。对于非重复位点如MUC4.1，级联放大是必不可少的，背景抑制进一步提高了SNR。此外，我们研究了级联放大复合物内的结合细节，发现d