冻干CRISPR-Cas9/sgRNA核糖核蛋白复合物靶向HPV-16/18的18个月内切酶活性稳定性评估

《Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids》：Estimation of endonuclease activity of lyophilized CRISPR-Cas9 and sgRNA assemblies targeting HPV-16 and HPV-18 up to 18 months

本研究针对CRISPR-Cas9内切酶活性在长期储存中的稳定性问题，由研究人员开展了靶向HPV-16和HPV-18的冻干CRISPR-Cas9/sgRNA复合物稳定性研究。通过体外转录sgRNA、组装核糖核蛋白（RNP）复合物并冻干，利用PCR、AGE和SYBR Green RT-PCR等技术验证，结果表明在4?°C储存长达18?个月后，RNP复合物仍保持显著的内切酶活性。该研究为CRISPR-Cas9技术在分子诊断和基因编辑中的长期应用提供了重要的稳定性保障策略。

　　

CRISPR-Cas9内切酶活性的稳定性对其在分子诊断和基因编辑中的应用效果至关重要。研究人员针对人乳头瘤病毒（Human Papillomavirus, HPV）16型和18型，通过多序列比对生成共有序列来选定靶序列，以确保高特异性。他们在HPV-16和HPV-18的E6基因内识别原间隔序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motif, PAM），进而设计单向导RNA（single guide RNA, sgRNA）。研究采用来自Integrated DNA Technologies (IDT)的高保真DNA寡核苷酸，并通过体外转录合成sgRNA。这些sgRNA随后与Cas9蛋白组装成CRISPR-Cas9核糖核蛋白（ribonucleoprotein, RNP）复合物，并经过冻干处理以提升其储存稳定性。在长达18个月的时间内，研究团队利用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction, PCR）、琼脂糖凝胶电泳（agarose gel electrophoresis, AGE）以及基于SYBR Green的实时荧光定量PCR（real-time PCR, RT-PCR）对RNP复合物的功能进行了验证，以确认其内切酶活性和切割效率。此项研究评估了在4?^oC条件下储存长达18个月的冻干HPV-16和HPV-18 CRISPR-Cas9-RNP的活性。结果表明，由sgRNA构成的核糖核蛋白（RNP）复合物保留了显著的内切酶活性，这支持了冻干作为一种可行的策略，可用于增强CRISPR-Cas9复合物的稳定性和保质期，以满足长期应用的需求。