建立菊苣属植物原生质体技术平台以应用新型基因组编辑技术：从细胞再生到无DNA基因编辑的创新突破

《New Biotechnology》：ESTABLISHING A CUTTING-EDGE PROTOPLAST TECHNOLOGY PLATFORM FOR APPLYING NEW GENOMIC TECHNIQUES IN CICHORIUM spp

本研究针对菊苣属(Cichorium spp.)植物原生质体再生效率低、品种依赖性强的技术瓶颈，开发了一套高效的原生质体分离、PEG介导转染和植株再生技术体系。研究人员通过对12个意大利菊苣和菊苣品种的系统优化，成功实现了从原生质体到完整植株的再生，并证实了RNP复合物的高效转染能力。该研究为菊苣属作物的DNA-free基因组编辑(CRISPR/Cas9)提供了可靠的技术平台，对加速育种进程和减少外源DNA整合风险具有重要意义。

　　

在植物育种领域，基因组编辑技术特别是CRISPR/Cas9系统的出现带来了一场革命。然而，尽管技术日益成熟，如何实现高效、无外源DNA整合的精准编辑仍然是制约其广泛应用的关键难题。传统的稳定转化方法需要将编辑工具整合到基因组中，不仅会产生转基因生物(GMO)，还需要通过多代杂交来去除外源基因，耗时耗力。相比之下，通过原生质体瞬时转染预组装的核糖核蛋白(RNP)复合物——即Cas9内切酶与特异性单链向导RNA(sgRNA)的结合体——提供了一种无DNA的编辑策略，能有效避免外源遗传物质的整合。

但是，建立标准化的原生质体再生体系仍然面临巨大挑战。不同品种和生物型之间再生效率存在显著差异，这使得从原生质体分离到完整植株再生的整个过程需要针对每个物种甚至每个品种进行繁琐的优化。菊苣属植物作为欧洲重要的园艺作物，特别是在意大利威尼托地区被称为"radicchio"的菊苣类型，具有丰富的表型多样性和高经济价值，是品质改良的重要目标。然而，该属植物的原生质体再生体系尚未建立完善，严重限制了基因组编辑技术在该作物中的应用。

为了解决这一技术瓶颈，来自意大利帕多瓦大学的研究团队在《New Biotechnology》上发表了一项重要研究，他们成功建立了一个高效的原生质体技术平台，为菊苣属植物应用新型基因组技术(NGTs)奠定了基础。

研究人员采用了系统化的方法开展研究，主要包括：从12个具有代表性的意大利菊苣和菊苣品种中分离叶肉原生质体；通过荧光素二乙酸酯(FDA)染色评估原生质体活性和完整性；比较两种包埋系统（低熔点琼脂糖LMPA和钙藻酸盐珠CAB）对原生质体培养的影响；使用两种再生培养基（MC3和MS10）诱导芽分化；通过流式细胞术分析再生植株的倍性稳定性；以及利用PEG介导的转染方法将Cas9-GFP融合蛋白导入原生质体评估转染效率。

研究结果展现了令人振奋的发现。在"原生质体分离效率和活性优化"方面，研究人员通过对酶组成和消化条件的优化，成功从所有12个生物型中分离出绿色球形原生质体，直径在20-60μm之间。产量达到每克鲜重2.5×10⁶到15.5×10⁶个原生质体，其中'Puntarelle'生物型产量最高，而'Catalogne'产量最低。原生质体活性通过FDA染色评估，范围在70%到97%之间，'Smooth endive'和'Early red of Treviso'表现出显著更高的活性。

在"原生质体培养和微愈伤组织形成"阶段，研究人员观察到所有菊苣生物型都经历了从"分离阶段"到"早期微愈伤组织"的逐渐有序进程。在培养的第3-5天，大多数包埋的原生质体出现初始有丝分裂细胞分裂。到第二周，所有生物型都进入细胞伸长阶段，细胞分裂更加明显，在CAB培养基中形成微菌落。有趣的是，在LMPA系统中，只有少数生物型能清晰识别微菌落发育，表明在光照条件下微菌落发育普遍延迟。

关于"愈伤组织增殖和芽分化"，研究发现12个测试的菊苣生物型中，有7个生物型支持持续的微愈伤组织生长，形成具有清晰形态定义的愈伤组织结构。其中'Curly endive'生物型在MS10培养基中表现出胚状细胞结构的发育，表明存在体外再生的潜在替代途径。ART ANOVA分析显示再生培养基对芽再生百分比有显著影响，而包埋方法、生物型及其所有交互作用的影响均不显著。

在"体外植株生长"阶段，MS10培养基中的培养物呈现出均匀的芽分化，没有玻璃化迹象，而MC3培养基中的培养物则出现较低的分化率和减少的器官发生反应。所有先前提到的能够进行芽再生的生物型在激素游离的MS培养基中都能实现根部出现和伸长。

关于"体内生长和形态学观察"，研究人员发现所有六个生物型都表现出一致的正常生长模式和规则器官形态，其表型和生长速率与对照植物相当。流式细胞术分析证实所有再生植株都保持稳定的二倍体基因组，没有多倍体化、非整倍体或混倍体证据。FDA染色显示在所有测试个体中都存在有活力的花粉，表明小孢子发生和雄配子体发育没有受到再生过程的影响。

最后，在"瞬时转染试验"中，PEG介导的瞬时转化在六个最佳表现的生物体中进行，转染效率估计在50%到71%之间。ANOVA显示六个生物型之间没有显著差异，尽管每个生物型的生物学重复之间存在一些变异性。GFP荧光信号在原质体中持续观察到，表现出弥漫的细胞质分布，而在某些情况下出现聚集或区室化定位。

该研究的结论部分强调了几个重要发现。研究人员成功开发了一套适用于菊苣属重要品种的高效原生质体再生程序，重点关注具有高园艺价值的叶用菊苣和菊苣生物型，包括Radicchio类型。优化的平台支持原生质体分离、PEG介导转染和植株再生，展示了未来基因组编辑应用的潜力。特别是原生质体对PEG介导转染的高反应性表明，将这种方法与再生程序结合可以促进先进生物技术策略的应用。

高瞬时转化效率、多功能封装技术和成功植株再生的结合，使菊苣和菊苣成为通过原生质体进行无DNA基因组编辑的有希望候选者，提供了一种技术精确的方法，与传统育种方法相比减少了环境和经济影响。这项研究不仅为通过基于原生质体的基因编辑加速菊苣属育种计划开辟了新途径，还能够确定最适合这种应用的最有希望的生物型。

研究人员还发现，尽管包埋策略（CAB与LMPA）在早期发育动力学上可能产生微小影响，但两种系统都能有效支持原生质体再生。然而，再生培养基的选择对芽再生效率有显著影响，MS10培养基相比MC3表现出更高的效率。所有再生植株都保持二倍体状态并具有可育的花粉，证明了该再生平台的可靠性。

最重要的是，该研究证实了菊苣属原生质体能够高效吸收外源材料，PEG介导的转染效率达到50-71%，为后续应用RNP复合物进行DNA-free基因组编辑奠定了坚实基础。这项研究为解决菊苣属作物育种中的技术瓶颈提供了全面解决方案，为未来开展精准基因组编辑、加速品种改良提供了可靠的技术平台。