基于F. rodentium Cas9结构功能解析的CRISPR-Cas蛋白工程新策略

《Cell Genomics》：Structural and functional bases of F. rodentium Cas9 provide insights into CRISPR-Cas protein engineering

本研究针对CRISPR-Cas9基因编辑技术存在的脱靶效应及PAM序列限制性问题，通过解析F. rodentium Cas9（FrCas9）的三维结构，揭示了其识别5'-NRTA-3' PAM的独特机制及sgRNA-DNA异源双链的过度缠绕特征。研究人员通过理性设计开发出高精度、高效率的eFrCas9变体，并在杜氏肌营养不良症（DMD）模型中实现大片段精准删除。该研究为下一代CRISPR工具的开发提供了结构基础，推动了基因治疗的安全性与适用性发展。

　　

基因编辑技术的崛起为生物医学领域带来了革命性变革，尤其是CRISPR-Cas9系统，因其高效性和灵活性成为遗传疾病治疗的热门工具。然而，广泛应用的SpCas9存在两大瓶颈：一是脱靶效应可能导致非目标位点的意外突变，二是其依赖的“NGG”原型间隔序列邻近基序（PAM）限制了基因组中特定区域的靶向能力。这些问题严重制约了CRISPR技术在临床治疗中的安全应用。

在此背景下，来源于Faecalibaculum rodentium的Cas9（FrCas9）因其独特的5'-NRTA-3' PAM识别特性及高编辑精度引起关注。该PAM序列富含AT碱基，尤其适用于靶向真核生物启动子区的TATA盒，但FrCas9的分子机制尚不明确。为此，杨梅等研究团队在《Cell Genomics》发表了题为“Structural and functional bases of F. rodentium Cas9 provide insights into CRISPR-Cas protein engineering”的研究，通过冷冻电镜技术解析了FrCas9-sgRNA-DNA复合物的结构，并结合功能实验开发出性能优化的eFrCas9变体，为精准基因编辑工具的设计提供了新范式。

关键技术方法

研究团队采用冷冻电镜（cryo-EM）解析了FrCas9-sgRNA-DNA复合物在R-loop扩展（RE）和预催化（PreC）两种状态下的高分辨率结构；通过AID-seq和GUIDE-seq技术系统性比较了FrCas9与SpCas9的脱靶效应；利用点突变和组合突变策略筛选出关键功能残基（如V1103K）；最后在永生化人骨骼肌成肌细胞（HsKMM）模型中评估eFrCas9对DMD基因大片段删除的效率和精准性。

研究结果

1. FrCas9具有低脱靶效应和高编辑效率

通过平行比较1,478个sgRNA的编辑效果，发现FrCas9的平均脱靶位点数量（58.57）显著低于SpCas9（386.31），且其on-target:off-target比值更高，表明FrCas9在保持高效切割的同时具备更优的特异性。

2. FrCas9-sgRNA-dsDNA复合物呈现两种构象状态

冷冻电镜结构显示，FrCas9在RE状态下形成15-bp的sgRNA-DNA异源双链，且异源双链在REC2和REC3结构域间发生独特过度缠绕，导致其螺旋倾角增加40°，这一特征可能增强其对错配的敏感性，从而提升编辑精度。PreC状态的结构则揭示了HNH结构域的部分密度及REC结构域的重排，为催化前的构象变化提供了动态视角。

3. 5'-NRTA-3' PAM的识别机制

结构分析表明，FrCas9的PI结构域通过残基Y1198、N1137、K1321等与PAM序列特异性结合，其中N1137负责识别第二位的嘌呤碱基（A/G）。功能实验证实，突变这些残基会显著降低编辑效率，且N1137A突变体对嘧啶碱基（C/T）的识别能力减弱，与结构观测一致。

4. 磷酸锁环（PLL）工程化提升性能

FrCas9的PLL元素（D1101-S1102-V1103）与目标DNA的+1位磷酸相互作用模式与SpCas9不同。饱和突变筛选发现，V1103K突变体可通过长侧链正电荷与异源双链小沟增强结合，使编辑效率提升30.15%，且未引入新脱靶位点。

5. 理性设计协同优化eFrCas9

结合PLL（V1103K）与PAM远端区突变（如N732A），构建的eFrCas9变体在体外切割实验中于0.25分钟内达到92.08%的切割效率，且脱靶活性降至9.58%。在DMD模型中，eFrCas9成功实现exon 45-55大片段删除，精准删除效率最高达17.25%，显著优于SpCas9。

结论与意义

本研究通过结构生物学与功能验证相结合，阐明了FrCas9高精度编辑的分子基础，并开发出兼具高效率和低脱靶的eFrCas9变体。其独特的PAM识别特性及异源双链构象为CRISPR-Cas系统的理性设计提供了新思路，尤其在靶向AT富集区域（如启动子）和复杂疾病（如DMD）的基因治疗中展现巨大潜力。该工作不仅推动了CRISPR工具的安全性优化，也为人工智能辅助Cas蛋白挖掘提供了结构模板。