增强UDP-阿拉伯糖的供应，并从Dipsacus asperoides中工程化获得糖基转移酶DaUGT121，用于在大肠杆菌中合成Cauloside A

《Engineering》：Enhancement of UDP-Arabinose Supply and Engineering of Glycosyltransferase DaUGT121 from Dipsacus asperoides for Cauloside A Biosynthesis in Escherichia coli

通过代谢工程优化大肠杆菌的UDP-阿拉伯糖（UDP-Ara）合成路径，并引入外源糖基转移酶DaUGT121，首次实现了cauloside A的微生物合成。研究通过阻断竞争代谢途径、增强UTP再生系统以及构建阿拉伯糖 salvage路径，显著提高了UDP-Ara的产量。工程菌株经5L fed-batch发酵后，cauloside A的得达到435.6 mg·L?1，为高附加值阿拉伯糖衍生物的工业化生产提供了新策略。

　　在自然界的生物化学反应中，糖基化是一种常见的修饰方式，能够显著影响化合物的生物活性与功能特性。其中，以阿拉伯糖为糖基供体的糖基化过程在某些具有重要药用价值的天然产物合成中占据关键地位。例如，一些具有抗真菌、抗癌等特性的化合物，其生物活性往往依赖于特定的阿拉伯糖基化结构。然而，由于阿拉伯糖供体尿苷二磷酸-阿拉伯糖（UDP-Ara）在植物中的含量极为有限，且传统提取方法往往破坏植物组织，使得从天然来源大规模获取UDP-Ara变得极具挑战性。为了解决这一问题，科学家们开始探索通过微生物转化的方式实现UDP-Ara的高效合成，并进一步利用该供体进行高价值糖基化产物的生物合成。本文研究的焦点便是如何通过系统性的代谢工程手段，构建一个高效的UDP-Ara合成平台，并最终实现一种名为“ Cauloside A”的阿拉伯糖基化三萜皂苷的微生物生产。

Cauloside A是一种从植物“ Dipsacus asperoides”中提取的天然产物，具有广泛的药理活性，包括抗炎、抗菌、细胞毒性、溶血作用以及杀螺活性。尽管其生物活性显著，但其天然来源的匮乏和复杂的化学结构，使得传统化学合成与植物提取方法难以满足工业化生产的需求。因此，寻找一种可持续且可扩展的合成途径成为研究的重点。通过微生物发酵技术，研究人员能够将复杂的天然产物合成过程转化到基因工程改造的微生物细胞中，从而实现对目标产物的高效生产。这一策略不仅能够避免对天然资源的过度依赖，还能通过调控基因表达与代谢通路，提高目标产物的产量与纯度。

在本文的研究中，研究人员以大肠杆菌（Escherichia coli）为底盘，系统地优化了UDP-Ara的合成路径，并引入了一种外源性的补救途径以增强UDP-Ara的供应。UDP-Ara的合成主要依赖于UDP-葡萄糖（UDP-Glc）的转化过程，因此，研究人员首先通过表达一系列关键酶，如UDP-葡萄糖脱氢酶（UGD）、UDP-葡萄糖-4-表异构酶（UGE）和UDP-阿拉伯糖-4-表异构酶（UXE），以促进UDP-Glc向UDP-Ara的转化。同时，为了提升UDP-Ara的供应，他们还对尿苷三磷酸（UTP）的再生途径进行了优化，通过提高UTP的浓度，从而间接促进UDP-Ara的合成。此外，研究人员还通过基因编辑技术，删除了可能与UDP-Ara合成路径竞争的基因，如葡萄糖-6-磷酸异构酶（pgi）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（zwf）以及UDP-葡萄糖-4-表异构酶（galE），从而将代谢流引导至UDP-Ara的合成方向。

为了进一步提高UDP-Ara的合成效率，研究人员还构建了一种补救途径，利用从“Paludisphaera borealis”中获得的阿拉伯糖激酶（AraK）和从“Arabidopsis thaliana”中获得的UDP-糖焦磷酸酶（USP），将阿拉伯糖直接转化为UDP-Ara。这一策略成功地解决了由于碳代谢阻遏（Carbon Catabolite Repression, CCR）而导致的UDP-Ara合成受限的问题。通过调控葡萄糖与阿拉伯糖的添加顺序与比例，研究人员实现了对UDP-Ara的高效合成，同时确保了细胞的正常生长。这一成果为后续的糖基化反应奠定了基础，使UDP-Ara能够作为糖基供体参与目标产物的合成。

在UDP-Ara合成完成后，研究人员进一步引入了一种关键的糖基转移酶DaUGT121，该酶来源于“Dipsacus asperoides”。通过实验验证，DaUGT121能够有效地催化UDP-Ara对三萜皂苷“hederagenin”（HG）的3-O-阿拉伯糖基化反应，从而生成Cauloside A。然而，DaUGT121在糖基供体选择上表现出一定的非特异性，既能够接受UDP-Ara，也能利用UDP-木糖（UDP-Xyl）作为供体。这种非特异性可能导致不必要的副产物生成，影响目标产物的纯度与产量。因此，研究人员通过结构导向的突变实验，对DaUGT121进行了优化，使其在保持UDP-Ara特异性的同时，显著提升了催化效率。特别是S302A突变体，其对UDP-Ara的催化效率比野生型提高了13倍，同时几乎完全失去了对UDP-Xyl的识别能力，从而确保了目标产物的高效合成。

为了进一步验证这一策略的有效性，研究人员在5 L的生物反应器中进行了分批补料发酵实验。通过精确控制葡萄糖与阿拉伯糖的添加比例，并在适当的时机引入HG作为糖基受体，最终成功地将Cauloside A的产量提升至435.6 mg/L。这一结果不仅标志着Cauloside A首次通过微生物发酵技术实现工业化生产，也展示了该策略在其他高价值阿拉伯糖基化天然产物合成中的潜在应用。通过这种组合性的代谢工程方法，研究人员不仅解决了UDP-Ara供应不足的问题，还优化了糖基转移酶的性能，从而实现了对复杂糖基化反应的高效催化。

该研究的意义不仅在于成功实现了Cauloside A的微生物合成，更在于为其他类似结构的天然产物提供了可复制的合成策略。传统的糖基化反应通常依赖于特定的酶和底物，而通过基因工程手段构建的UDP-Ara合成路径与优化的糖基转移酶系统，为开发更广泛的糖基化生物合成平台提供了理论依据和技术支持。此外，本文所采用的代谢工程策略，如竞争通路的删除、UTP再生系统的构建以及补救途径的引入，为后续的天然产物合成研究提供了重要的参考。

在实际应用中，这种微生物合成平台具有显著的优势。首先，它能够实现对稀缺天然产物的高效生产，避免对天然资源的过度依赖。其次，通过基因工程手段，可以灵活调控代谢通路，提高目标产物的产量与纯度。此外，该平台还具备良好的可扩展性，能够在不同规模的发酵系统中应用，从而满足工业化生产的需求。最后，该研究还揭示了糖基转移酶在底物特异性识别中的关键作用，特别是通过结构分析与突变实验，为酶工程提供了新的思路与方法。

综上所述，本文的研究成果不仅在Cauloside A的微生物合成方面取得了突破，还为其他高价值糖基化天然产物的合成提供了重要的技术框架。通过系统性的代谢工程策略与糖基转移酶的优化，研究人员成功构建了一个高效的UDP-Ara合成系统，并实现了Cauloside A的高效生产。这一成果为生物合成技术的发展提供了新的方向，同时也为药物开发与天然产物研究带来了重要的应用前景。未来的研究可以进一步探索该平台在其他类似结构化合物中的适用性，并通过更精细的调控手段，实现更高产率与更高质量的产物合成。