综述：基于CRISPR/Cas系统的病原菌检测策略

《TrAC Trends in Analytical Chemistry》：CRISPR/Cas system-based strategies for pathogenic bacteria detection

本综述系统阐述了CRISPR/Cas（成簇规律间隔短回文重复序列及其相关蛋白）系统作为一种新兴的分子工具，在病原菌检测领域的应用进展。文章重点介绍了CRISPR/Cas系统的起源、分类、工作原理，并详细评述了基于Cas9、Cas12、Cas13、Cas14等效应蛋白，结合多种核酸扩增技术（如PCR、RPA、LAMP等）和信号输出模式（如荧光、比色、电化学等）的检测策略。该技术凭借其高特异性、灵敏度及快速性，为食品安全、临床诊断和环境监测提供了强大平台，未来发展潜力巨大。

　　

引言

病原菌，如金黄色葡萄球菌（S. aureus）、沙门氏菌、单核细胞增生李斯特菌（L. monocytogenes）等，是引发呼吸道疾病、消化系统感染等多种人类疾病的主要元凶。因此，对病原菌进行特异、灵敏且快速的检测，对于保障公共卫生安全至关重要。传统的检测方法，如显微镜检查、微生物培养、分子生物学鉴定等，往往受限于耗时长、操作复杂、依赖大型仪器以及假阳性/假阴性结果等问题。近年来，CRISPR/Cas系统因其在识别和切割核酸序列方面的高特异性，已成为开发病原菌检测方法的强大平台。

CRISPR/Cas系统：起源、发展、分类、工作原理和应用

CRISPR/Cas系统于1987年在大肠杆菌（E. coli）中被首次发现，随后在其他细菌和古菌中得到证实。该系统原是细菌抵御外来遗传元件（如噬菌体）入侵的适应性免疫系统。其工作机制通常包含三个阶段：外源DNA捕获、crRNA（CRISPR相关RNA）合成以及靶向干扰。当外源DNA入侵时，Cas蛋白复合物识别其原型间隔序列邻近基序（PAM），切割并将一段外源序列整合到宿主CRISPR基因座中，形成免疫记忆。在表达阶段，CRISPR序列被转录成前体crRNA，并加工成成熟的crRNA。成熟的crRNA与Cas效应蛋白结合形成复合物，特异性识别并杂交外源基因序列，从而激活Cas蛋白切割外源核酸，实现降解。

基于效应蛋白的结构，CRISPR/Cas系统可分为两大类。Class 1系统由多种Cas蛋白复合物构成，而Class 2系统则由单个多功能的Cas蛋白（如Cas9, Cas12, Cas13, Cas14）主导，因其设计简单、效率高而被广泛应用。这些效应蛋白各具特色：Cas9主要靶向双链DNA（dsDNA），但其切割不具有“反式切割”活性；Cas12在靶向dsDNA后，会被激活并非特异性切割周围的单链DNA（ssDNA），即反式切割；Cas13是RNA指导的RNA切割酶，同样具有反式切割活性；Cas14则是一种靶向ssDNA的小型核酸酶，且其活性不依赖于PAM序列。这些特性为开发多样化的病原菌检测方法奠定了基础。

CRISPR/Cas系统基于病原菌的检测

CRISPR/Cas9系统基于病原菌的检测

CRISPR/Cas9系统由Cas9蛋白、crRNA和反式激活crRNA（tracrRNA）组成，两者可融合成单向导RNA（sgRNA），简化了设计。研究人员将CRISPR/Cas9与环介导等温扩增（LAMP）、链置换扩增（SDA）等技术结合，并与侧向流动层析试纸条（LFS）、荧光、表面增强拉曼散射（SERS）等信号输出方式联用，成功检测了沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7、单核细胞增生李斯特菌等多种病原菌。例如，有研究通过Cas9/sgRNA复合物特异性识别荧光标记的PCR扩增产物，再通过LFS上的金纳米颗粒显色，实现了沙门氏菌的灵敏、可视化检测。还有工作利用dCas9（失去切割活性的Cas9）与SERS技术结合，通过检测嵌入细菌基因组DNA的信号分子，实现了对肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）、鲍曼不动杆菌（A. baumannii）等的检测。然而，Cas9系统存在脱靶率较高的问题，可能影响检测准确性。

CRISPR/Cas12系统基于病原菌的检测

CRISPR/Cas12系统（尤其是Cas12a）因其反式切割活性而备受关注。当Cas12a/crRNA复合物结合靶标dsDNA后，会被激活并切割反应体系中的ssDNA报告探针（如荧光-淬灭基团标记的ssDNA），产生信号。这种特性使其能与重组酶聚合酶扩增（RPA）、重组酶辅助扩增（RAA）、环介导等温扩增（LAMP）等多种等温扩增技术高效结合，实现信号的极大放大。研究人员利用此原理，开发了针对创伤弧菌（V. vulnificus）、多重耐药鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、单核细胞增生李斯特菌等的荧光、比色及电化学检测方法，展现了高灵敏度（可达1-10 CFU/mL）和快速性（通常在数十分钟至2小时内完成）。与Cas12a相比，对耐热性更佳的Cas12b的研究相对较少，但其在病原菌检测方面颇具潜力。

CRISPR/Cas13系统基于病原菌的检测

CRISPR/Cas13系统是RNA指导的RNA切割系统，其显著特点是具有反式切割活性，且其靶向识别依赖于原型间隔序列侧翼序列（PFS），而非PAM。典型的策略是将病原菌的特异DNA序列通过PCR等技术扩增后，利用T7启动子等体外转录成RNA，该RNA再激活Cas13a反式切割荧光报告RNA，从而产生检测信号。这种方法避免了直接检测RNA易降解的问题，并通过DNA扩增和转录双重放大，实现了对沙门氏菌、金黄色葡萄球菌等的高灵敏检测。还有研究将CRISPR/Cas13a与化学发光共振能量转移（CRET）技术和免疫层析试纸条结合，无需核酸提取和扩增，即可实现食品中金黄色葡萄球菌的现场、快速检测。微滴数字PCR与CRISPR/Cas13a的结合，则实现了对单个病原菌RNA分子的绝对定量。

CRISPR/Cas14系统基于病原菌的检测

CRISPR/Cas14系统能够直接靶向ssDNA，且不依赖PAM序列，这为靶序列的选择提供了更大的灵活性。由于其蛋白尺寸较小，并能有效识别ssDNA中的单碱基突变，因此在特异性区分方面具有优势。已有研究利用CRISPR/Cas14a结合荧光信号输出，成功检测了化脓性链球菌（S. pyogenes）、伤寒沙门氏菌（S. typhi）以及耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）等。通过设计特异性引物和sgRNA，甚至可以在同一反应中同时鉴别六种不同的病原菌，展示了其在多重检测方面的应用前景。不过，由于Cas14a仅切割ssDNA，在检测dsDNA靶标时通常需要额外的变性步骤。

总结与展望

本综述系统总结了基于CRISPR/Cas系统（Cas9, Cas12, Cas13, Cas14）的病原菌检测策略，这些策略通过与不同的核酸扩增技术和信号读出模式（荧光、比色、电化学、SERS等）相结合，实现了对多种病原菌的高灵敏、高特异和快速检测。当前的检测模式主要分为基于核酸提取与扩增的模式和无需核酸提取的模式。前者灵敏度高，适用于低菌量样本，但操作相对复杂；后者更快速简便，但可能受限于样本中非特异性物质的干扰和灵敏度。

尽管CRISPR/Cas系统在病原菌检测中展现出巨大潜力，但仍面临一些挑战：（1）脱靶效应可能影响检测准确性，未来可结合人工智能或机器学习优化核酸设计。（2）多数方法依赖核酸扩增，过程复杂且可能引入非特异性扩增，开发无需提取和扩增的直接检测方法是重要方向。（3）部分Cas蛋白（如Cas9, Cas12a, Cas13）的PAM/PFS依赖性限制了靶序列选择，可通过DNA变性或蛋白质工程改造Cas蛋白来克服。（4）多重病原菌同步检测技术仍需进一步探索。（5）推动检测设备的小型化、便携化，发展更多适用于现场检测的试纸条等方法。（6）对Cas13b、Cas14等新型效应蛋白的研究有待深入。

未来，CRISPR/Cas系统的应用有望从体外检测延伸至活细胞及活体水平，实现对细胞内病原菌的原位、实时分析和追踪，为疾病机理研究和精准诊疗开辟新途径。随着新Cas蛋白的发现、现有系统的优化以及新机制的阐明，CRISPR/Cas技术必将在病原菌检测领域持续带来新的突破。