CRISPy-web 3.0：一个用于CRISPR和TnpB基因组编辑应用的多模态引导RNA设计的统一平台

《Systematic and Applied Microbiology》：CRISPy-web 3.0: a unified platform for multi-modal guide RNA design for CRISPR and TnpB genome editing applications

CRISPy-web 3.0 是首个支持Cas9、CRISPRi和TnpB/ωRNA系统的多模式基因组编辑平台，提供基因组可视化、动态评分系统和跨模式比较功能，特别优化了非模式微生物的编辑设计。

　　CRISPy-web 3.0 是一个交互式的网络平台，专门用于基于 CRISPR-Cas9 的基因组编辑系统中的理性引导 RNA（gRNA）设计。该平台的更新版本不仅扩展了其功能，还增强了对多种基因编辑系统的支持，包括传统的 Cas9 系统、CRISPRi（CRISPR 干扰）以及 TnpB/ωRNA 系统。通过这一升级，CRISPy-web 3.0 成为了一个更加灵活和可扩展的工具，为微生物基因组编辑提供了更全面的解决方案。

CRISPR 技术自问世以来，已经成为基因组工程领域的重要工具。它允许科学家以高度精确的方式对 DNA 进行编辑，从而实现对基因功能的调控。在微生物研究中，这一技术的应用尤为广泛，尤其是在抗生素生产、天然产物合成以及代谢通路优化等方面。然而，传统的 CRISPR-Cas9 系统在实际应用中仍然面临一些挑战，例如脱靶效应（off-target effects）和编辑效率的波动。为了解决这些问题，研究人员不断探索新的编辑策略和工具，如 CRISPRi 和 TnpB/ωRNA 系统，这些系统能够实现非破坏性的基因表达调控和更紧凑的基因编辑方式。

CRISPy-web 3.0 的推出正是为了应对这些挑战，并提供一个统一的平台，支持多种编辑模式。这一版本不仅保留了 Cas9 系统的功能，还加入了对 CRISPRi 和 TnpB/ωRNA 的支持。这种多模式设计使得研究人员可以在同一平台上进行不同类型的基因组操作，例如基因敲除、基因表达调控以及精确的碱基编辑。此外，CRISPy-web 3.0 还引入了更先进的评分系统，用于评估引导 RNA 的效率和特异性。评分系统考虑了多种因素，包括错配容忍度、位置上下文以及 PAM（Protospacer Adjacent Motif）区域的要求，从而帮助用户更精准地选择最佳的引导 RNA。

在设计 CRISPy-web 3.0 时，研究人员特别关注了微生物基因组的特殊性。与真核生物不同，原核生物的基因组结构和调控机制存在显著差异，这使得传统的基因编辑工具在微生物中的应用面临一定的限制。因此，CRISPy-web 3.0 在设计过程中充分考虑了这些差异，例如在 CRISPRi 应用中，平台特别强调了对非模板链（coding strand）的靶向选择，因为这一选择通常能够提高转录抑制的效果。这一特性在原核生物中尤为重要，因为 dCas9 或 dCpf1 在模板链上的结合往往无法有效阻止 RNA 聚合酶的延伸过程。

为了提升用户体验，CRISPy-web 3.0 采用了全新的界面设计，使用户能够更直观地操作和分析数据。平台支持多种基因组格式，包括 FASTA 和 GenBank，这使得用户能够灵活地上传自己的基因组数据或直接从反式作用元件分析系统（antiSMASH）中获取序列信息。对于未注释的基因组，用户可以借助 BAKTA、RAST 等工具进行预处理，从而获得更准确的基因注释信息。这一功能极大地提高了 CRISPy-web 3.0 的适用范围，使其能够支持广泛的微生物研究。

除了支持多种基因编辑系统，CRISPy-web 3.0 还提供了强大的可视化工具。用户可以查看候选引导 RNA 的位置、方向以及与目标基因的关系，同时平台还能展示脱靶分析结果和编辑窗口的预测信息。这种交互式的设计不仅提高了数据的可读性，还增强了用户的分析能力。用户可以根据脱靶数量、位置或评分对引导 RNA 进行排序和筛选，从而快速找到最优的编辑方案。此外，所有结果都可以以 CSV 格式导出，方便后续的实验设计和数据处理。

CRISPy-web 3.0 的一个重要特点是其支持 TnpB/ωRNA 系统。TnpB 是一种源自 IS200/IS605 家族转座子的内切酶，它与传统的 CRISPR-Cas 系统相比，具有更小的蛋白体积和更简单的 RNA 引导结构。这一特性使得 TnpB 在体内应用中更加便捷，尤其是在难以递送大型蛋白的环境中。通过支持 TnpB/ωRNA 系统，CRISPy-web 3.0 为研究人员提供了一个全新的基因编辑工具选择，特别是在合成生物学和微生物基因组工程领域。平台还能够根据用户指定的 TnpB 类型、TAM（Target Adjacent Motif）序列、引导 RNA 长度和编辑窗口参数，自动扫描并识别潜在的 ωRNA 靶点，从而实现高效的碱基编辑。

在碱基编辑模式下，CRISPy-web 3.0 可以预测引导 RNA 引入的 DNA 和氨基酸层面的突变，帮助用户更直观地了解编辑结果。同时，平台还提供了“仅 STOP 突变”筛选功能，方便用户在基因敲除研究中快速找到合适的引导 RNA。这种多层次的分析能力使得 CRISPy-web 3.0 在基因组编辑的精确性和效率方面具有显著优势。

CRISPy-web 3.0 的另一个重要创新是其“专家模式”。这一模式允许高级用户自定义各种参数，例如酶变体、PAM/TAM 序列、引导 RNA 长度和编辑窗口。这种高度可定制的设计不仅满足了不同研究需求，还为研究人员在快速发展的 CRISPR 和 TnpB 技术体系中提供了更大的灵活性。专家模式的引入，使得 CRISPy-web 3.0 能够支持更复杂的实验设计，如基因激活、基因表达调控和高通量筛选等。

为了展示 CRISPy-web 3.0 的功能，研究人员以放线菌（*Streptomyces coelicolor*）中的 actinorhodin 合成基因簇（region 11: 5,509,800–5,552,424 bp）为案例，进行了多模式基因组编辑的演示。通过这一案例，用户可以直观地看到 CRISPy-web 3.0 在不同编辑模式下的表现，包括 CRISPRi、CRISPR-BEST 和 TnpB/ωRNA 等。平台不仅能够识别潜在的引导 RNA 靶点，还能够预测编辑效果，并提供详细的脱靶分析。这种多模式比较和流程优化的能力，使得 CRISPy-web 3.0 成为了一个极具价值的工具，特别是在微生物基因组工程和天然产物通路优化方面。

在功能方面，CRISPy-web 3.0 相较于其他主流的引导 RNA 设计工具，具有显著的优势。例如，CHOPCHOP、BE-Designer、GuideScan 和 CRISPOR 等工具虽然也支持多种编辑模式，但在支持非模型微生物基因组、脱靶分析和参数自定义等方面存在局限。而 CRISPy-web 3.0 通过整合多种功能模块，实现了对 Cas9、CRISPRi 和 TnpB/ωRNA 系统的全面支持。这种统一的设计理念不仅提高了平台的灵活性，还增强了其在基因组编辑领域的适应性。

此外，CRISPy-web 3.0 的后端架构支持大规模基因组设计和批量处理，这使得它能够满足高通量实验的需求。随着 CRISPR 和 TnpB 技术的不断发展，研究人员需要更强大的计算工具来应对新的挑战。因此，CRISPy-web 3.0 的设计充分考虑了这一需求，其模块化结构和可扩展性使其能够快速集成新的编辑酶和靶点识别策略。未来，平台计划增加对原位编辑（prime editing）的支持，并拓展用于群体筛选（pooled screens）的库级设计功能，以进一步提升其在基因组编辑领域的应用价值。

CRISPy-web 3.0 的推出，标志着微生物基因组编辑工具的一个重要进步。它不仅整合了多种基因编辑系统，还通过先进的评分机制和交互式界面，提高了引导 RNA 设计的准确性和效率。对于研究人员来说，这一平台提供了一个更加全面和灵活的解决方案，使其能够更高效地进行基因组编辑实验。特别是在天然产物研究和合成生物学领域，CRISPy-web 3.0 的功能将为基因功能的探索和基因工程的应用提供强有力的支持。

总体而言，CRISPy-web 3.0 的出现，不仅丰富了基因组编辑工具的选择，还推动了微生物基因组工程的发展。它通过多模式设计、交互式界面和强大的数据分析功能，为研究人员提供了一个更加直观和高效的平台。随着 CRISPR 技术的不断演进，CRISPy-web 3.0 有望在未来成为微生物基因组编辑领域的重要工具，帮助科学家更深入地探索基因功能，并实现对微生物基因组的精准调控。