一种多重RPA-CRISPR/Cas12a平台，用于快速准确地鉴定产气荚膜梭菌的毒素类型

《Talanta》：A Multiplex RPA-CRISPR/Cas12a Platform for Rapid and Accurate Toxinotyping of Clostridium perfringens

本研究开发了集成多plex RPA与CRISPR/Cas12a的快速检测平台，可同时鉴定产气荚膜梭菌六种毒素基因并区分七种毒素型。检测限≤10 copies/μL，特异性强，验证显示其优于商业qPCR试剂盒，便携设备50分钟完成全流程，适用于资源有限地区的食品中毒素监测，为全球食品安全倡议提供技术支持。

　　在当今全球食品安全形势日益严峻的背景下，快速、准确的病原体检测技术对于有效控制和监测食源性疾病暴发具有重要意义。特别是对于*Clostridium perfringens*（产气荚膜梭菌），这种细菌是全球范围内导致食源性疾病的首要原因之一，因此开发高效的分子分型方法显得尤为迫切。现有的检测手段虽然在实验室环境中表现出色，但往往依赖复杂的设备和专业人员，这在资源有限的地区或紧急情况下显得不够灵活。为此，研究人员开发了一种集成化的检测平台，结合了多重重组酶介导的等温扩增（RPA）技术和CRISPR/Cas12a介导的检测方法，从而实现了对*Clostridium perfringens*多种毒力基因的快速识别和分型。

该平台的设计理念源于对现有检测技术的全面评估。传统的诊断方法通常依赖于培养技术结合毒力基因分析，这种流程耗时较长，通常需要24至72小时才能得出最终结论。尽管近年来核酸扩增技术，尤其是多重聚合酶链式反应（PCR）和定量PCR（qPCR）在实验室检测中得到了广泛应用，但这些技术对热循环仪、专业操作人员和实验室环境的高度依赖，使其难以在资源有限或现场应急情况下进行应用。因此，开发一种操作简便、无需复杂设备、能够在现场快速完成检测的点对点检测（POCT）技术成为研究热点。

CRISPR/Cas12a技术因其高特异性、灵敏度和快速检测能力而受到广泛关注。该技术能够通过单链引导RNA（sgRNA）实现序列特异性识别，并在识别目标序列后触发非特异性切割活动，从而放大检测信号。这一特性使得CRISPR/Cas12a在病原体检测领域展现出巨大潜力。近年来，研究人员尝试将CRISPR/Cas12a技术与等温扩增技术相结合，以提升检测效率。例如，Li等人开发了一种基于CRISPR/Cas12a和等温扩增技术的检测系统，用于检测*Bacillus cereus*（蜡样芽孢杆菌），而Lee等人则构建了类似的系统用于检测*Escherichia coli* O157:H7（大肠杆菌O157:H7）。然而，这些方法大多局限于单一毒力基因的检测，难以满足对复杂病原体进行全面分型的需求。

针对上述问题，研究人员提出了一种创新的POCT平台，将多重RPA与CRISPR/Cas12a检测相结合，从而实现对*Clostridium perfringens*多种毒力基因的快速识别。该平台采用了简化的两步流程：首先，利用重组酶-引物复合物在37°C条件下对六种毒力基因（*cpa*、*cpb*、*etx*、*iap*、*cpe*、*netB*）进行等温扩增，避免了传统PCR所需的热循环过程；随后，通过CRISPR/Cas12a介导的检测方法，利用目标特异性CRISPR RNA（crRNA）引导Cas12a蛋白识别并切割相应的扩增产物，从而生成可检测的荧光信号。这一整合方法不仅提升了检测的灵敏度，还确保了检测的特异性，避免了交叉反应，为现场快速诊断提供了可靠的技术支持。

该平台的检测流程经过严格的验证测试，包括对12份自然污染的食品样本进行检测。结果显示，该平台在检测效率和准确性方面均优于市面上的商业qPCR试剂盒，能够准确识别八种类型A（*cpa*基因阳性）和四种类型F（*cpa*和*cpe*基因共同阳性）的菌株。此外，当该平台与便携式检测设备结合使用时，能够在50分钟内完成整个检测流程，同时在实际应用环境中保持与实验室水平相当的检测精度。这种快速、经济、无需复杂设备的检测系统特别适合用于资源有限地区的食品毒力监测工作。

*Clostridium perfringens*的毒力基因具有高度保守的序列，这一特性为基于毒力基因的分型检测提供了可靠的基础。例如，α毒素在所有毒力类型中均存在，并且其序列同源性超过97%。其他毒力基因的序列也表现出至少90%的保守性，这使得基于这些基因的检测方法能够有效区分不同类型的菌株。同时，该平台能够同时检测六种关键毒力基因，从而实现对七种毒力类型（A-G）的全面分类。这种能力对于食品安全监测和疾病暴发控制具有重要意义，因为它能够帮助公共卫生部门快速识别潜在的高风险菌株，从而采取针对性的防控措施。

此外，该平台的开发也符合世界卫生组织（WHO）提出的食品安全倡议2030的目标。通过在资源有限地区推广这种便携、经济、高效的检测技术，可以实现对食品供应链的分散化监控，从而提高食品安全的整体水平。这种技术不仅能够提升现场检测的效率，还能够降低检测成本，为全球范围内的食品安全管理提供有力支持。

在实际应用中，该平台的优势在于其操作简便性和快速检测能力。相比传统的实验室检测方法，该平台无需复杂的设备和专业人员，只需简单的操作步骤即可完成检测。这种特性使其特别适合用于现场应急检测，例如在食品污染事件发生后，能够迅速识别病原体类型，为公共卫生部门提供及时的决策支持。同时，该平台的便携性也使得其能够在偏远地区或资源有限的环境中广泛应用，从而提升食品安全监测的覆盖率。

为了确保检测的准确性和可靠性，研究人员对RPA引物进行了系统的筛选和优化。通过组合测试和性能评估，研究人员确定了最佳的引物组合，使其能够在37°C条件下对六种毒力基因进行高效扩增。这一过程不仅简化了检测流程，还提高了检测的灵敏度，使得即使在低浓度样本中也能实现准确的检测结果。此外，研究人员还对CRISPR/Cas12a检测部分进行了优化，确保其在识别目标序列后能够触发非特异性切割活动，从而放大检测信号，提高检测的准确性。

该平台的检测流程包括多个关键步骤，从样本采集到最终结果的可视化，均采用了优化的技术方案。首先，研究人员通过RPA技术对样本中的DNA进行扩增，这一过程不需要热循环仪，能够在短时间内完成。随后，利用CRISPR/Cas12a技术对扩增产物进行检测，这一过程不仅提高了检测的特异性，还确保了检测结果的可靠性。最终，通过便携式检测设备实现结果的可视化，使得检测结果能够被快速获取和分析。

在实际应用中，该平台的检测能力得到了验证。通过检测12份自然污染的食品样本，研究人员发现该平台能够准确识别多种毒力类型，其检测结果与商业qPCR试剂盒相比具有更高的准确性和效率。此外，该平台的检测时间仅需50分钟，这一时间优势使其在紧急情况下能够快速提供检测结果，为公共卫生部门的决策提供支持。同时，该平台的检测结果在实验室和现场环境中均表现出一致性，这表明其在实际应用中的可靠性。

该平台的开发不仅解决了现有检测技术在资源有限地区应用的难题，还推动了点对点检测技术的发展。通过结合多重RPA和CRISPR/Cas12a技术，研究人员创造了一种高效、经济、便携的检测系统，能够在短时间内完成对多种毒力基因的检测。这种系统不仅适用于食品安全监测，还能够用于临床诊断和农业病原体监测，为不同领域的公共卫生工作提供技术支持。

此外，该平台的开发也体现了对全球食品安全形势的深刻理解和应对策略。通过推广这种快速、准确的检测技术，可以有效提升食品安全监测的效率，降低疾病暴发的风险。同时，该平台的便携性和经济性使其能够在全球范围内广泛应用，特别是在发展中国家和资源有限地区，为这些地区的食品安全管理提供有力支持。

总之，*Clostridium perfringens*多重RPA-CRISPR/Cas12a检测平台的开发，标志着食品安全检测技术的一次重要突破。该平台结合了多重RPA的高灵敏度和CRISPR/Cas12a的高特异性，使得在短时间内完成对多种毒力基因的检测成为可能。这种技术不仅能够提升现场检测的效率，还能够降低检测成本，为全球食品安全监测提供新的解决方案。通过在实际应用中的验证，该平台展现出良好的性能，为食品安全管理和疾病暴发控制提供了可靠的技术支持。