综述：作物改良的涡轮增压：利用多重编辑技术进行多基因性状工程及超越

《The Plant Journal》：Turbo-charging crop improvement: harnessing multiplex editing for polygenic trait engineering and beyond

本综述系统阐述了多重CRISPR编辑技术在植物基因组工程中的革命性进展，重点介绍了其在解析基因家族功能、克服遗传冗余、加速多基因性状（如抗病性、抗逆性）改良、实现性状叠加及从头驯化等方面的突破性应用。文章还探讨了该技术在表观遗传调控、染色体工程等前沿领域的拓展，并深入分析了当前工具包的技术挑战（如载体构建复杂性、突变检测）与未来发展方向（如AI辅助设计、时空可控编辑），为下一代作物精准设计育种提供了全面视角。

　　

多重CRISPR编辑技术作为植物基因组工程的一个变革性平台，能够同时靶向多个基因、调控元件或染色体区域。这种方法对于解析基因家族功能、解决遗传冗余问题、设计多基因性状、加速性状叠加以及实现从头驯化都非常有效。其应用现已超越标准基因敲除，扩展到表观遗传和转录调控、染色体工程以及无转基因编辑等领域。这些能力不仅推动了如一年生作物等物种的改良，也在更复杂的系统中取得进展，例如多倍体、未驯化的野生近缘种以及具有长世代周期的物种。

多重编辑技术克服遗传冗余

基因复制和基因家族在植物基因组中普遍存在。同源基因或基因家族成员的功能冗余（无论是完全、部分还是重叠冗余）对解析重要性状背后的因果基因机制构成了主要挑战。CRISPR编辑在基因、旁系同源基因和家族水平上的精确性和多功能性，相较于先前的基因沉默方法（如反义RNA、RNAi、microRNA），在区分高度同源基因的特异性和冗余性角色方面提供了显著改进。

串联排列基因（TAGs）源自串联复制，构成了植物基因组的相当大部分。它们的高度序列相似性和功能冗余通常需要多基因敲除才能进行有效的功能分析。多重CRISPR编辑使得对TAGs进行功能解析变得可行，而这是传统遗传方法难以实现的。

CRISPR基因组编辑对于具有固有复杂基因组的多倍体物种来说是一个改变游戏规则的工具。例如，甘蔗品种是多倍体/非整倍体种间杂交种，拥有10-13套基本染色体。同样，木本竹类包含1500多种四倍体或六倍体物种，具有12条染色体。因此，即使在单基因靶点的情况下，多重（多等位基因）编辑对于在多倍体物种中获得无效突变体也是必不可少的。

定量性状工程与叠加

植物性状很少由单基因控制，这使得多重基因编辑成为加速性状改良的有力工具。在番茄中，通过同时编辑三个基因（PSY1、MYB12和SGR1），每个基因使用两个gRNA，成功 engineered 了果实颜色的多样性。在不到一年的时间内，通过回交和转基因游离F₁植株的自交，产生了具有新颖果实颜色的分离群体。

在谷物中，膳食纤维和抗性淀粉含量受多个淀粉合酶和淀粉分支酶基因的影响。对小麦和水稻中SBE基因的多重编辑显著增加了直链淀粉和抗性淀粉水平，在高阶突变体中效果更强。在烟草中，同时编辑两个β-1,2-木糖基转移酶基因和四个α-1,3-岩藻糖基转移酶基因，成功改变了植物源治疗蛋白的N-糖基化模式。

多重基因编辑特别适合叠加跨越多个性状的理想等位基因。在水稻中，将温敏雄性不育性和抗病性同时引入到一个育种系中。在玉米中，BREEDIT管道将多重基因组编辑与传统杂交相结合，靶向48个生长相关基因，产生了超过1000个编辑株系，实现了等位基因叠加、固定突变的回收以及通过策略性杂交产生新的编辑。

多重编辑还使得能够对作物野生近缘种进行从头驯化，通过直接靶向驯化基因同时保留有益性状以扩大基因库。在长寿物种如杨树中，多重编辑可以绕过长的世代时间来加速研究发现。

超越基因敲除

多重启动子编辑是微调基因表达而无需事先了解顺式调控元件的强大策略。当应用于转录因子等调控基因时，启动子编辑不仅可以影响特定转录因子的表达，还可以影响其上游调控因子、下游靶标以及其他相互作用伙伴。这些级联效应可能导致复杂的表型结果。

多重CRISPR系统已被改造用于转录调控和表观遗传修饰，而无需改变DNA序列。核心设计使用催化失活的Cas9（dCas9）通过多个gRNA进行位点特异性靶向，效应结构域可以直接与dCas9融合或通过诸如SunTag、MoonTag系统或修饰的gRNA支架进行招募。用于表观遗传修饰的效应器包括来自DNA甲基转移酶、去甲基化酶以及细菌、哺乳动物或植物来源的组蛋白乙酰转移酶的催化结构域。

染色体工程

多重CRISPR工具包已被用于诱导靶向染色体重排，包括倒位、易位和臂交换。在玉米中，在着丝粒两侧同时诱导双链断裂产生了染色体2上75.5 Mb的着丝粒周围倒位。在拟南芥中，染色体2端粒末端附近的两个DSB导致了一个可遗传的约17 Mb倒位。多重编辑还能够逆转染色体4上1.1 Mb异染色质结（hk4S）倒位——这是一个估计在大约5000年前发生在某些拟南芥种质中的古老重排。

非转基因编辑作物

基因编辑作物面临的最大挑战之一是管理转基因植物的监管框架，这不仅阻碍了商业化，也阻碍了性状评估所必需的田间试验。这强调了对非转基因CRISPR-Cas技术的需求。无DNA编辑最初通过将预组装的Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）直接递送到原生质体中进行植物再生来证明。

作为替代方案，农杆菌介导的多重CRISPR构建体的瞬时表达，结合正负选择，已在多种物种中显示出前景。碱基编辑或基因靶向在ALS（乙酰乳酸合酶）中引入功能获得性突变，以赋予对磺酰脲类除草剂（如氯磺隆）的抗性，同时靶向感兴趣的一个或多个基因进行诱变。

技术考量与挑战

随着多重编辑复杂性的增加，必须表达的gRNA数量也随之增加。对于CRISPR-Cas9系统，通常使用两种方法：（1）每个gRNA由其自身的启动子（通常是Pol III启动子）驱动；（2）单个（Pol II或Pol III）启动子驱动多顺反子gRNA阵列的表达，其中单个gRNA由可切割的RNA元件（如tRNA、自切割核酶或外源核酸酶（如Csy4）的识别序列）分隔开。

在突变检测方面，从早期的限制性酶切位点分析和T7内切酶I消化，发展到现在的扩增子测序和长读长测序技术，能够更全面地解析复杂的编辑结果。全基因组测序提供了对靶向和非靶向效应最全面的视角，但对于大多数植物物种来说，成本仍然过高。

结论与未来展望

多重基因编辑正在重塑植物生物技术和作物改良的格局。它通过实现对复杂性状的同时和组合操作，为传统育种和单基因编辑提供了一种高效且可扩展的替代方案。随着工具包变得更加复杂和易于使用，以及用于检测复杂编辑结果的分析流程的改进，多重编辑有望成为基础研究和应用育种计划中的核心技术。

除了编辑基因和调控序列之外，多重方法将有助于靶向高度重复和以前难以处理的基因组区域，例如转座因子、卫星或串联重复序列以及异染色质。这些区域蕴藏着理解基因组功能和开辟性状创新新途径的未开发潜力。

未来的努力应侧重于改进gRNA效率预测以提高编辑性能，最大限度地减少脱靶效应，并开发稳健且物种无关的递送系统，特别是对于难以转化、多年生和/或多倍体物种。人工智能、机器学习和大型语言模型日益融入植物育种和生物工程研究，为简化实验设计、优化构建体组装策略和预测编辑结果提供了强大的工具。随着CRISPR试剂、合成生物学工具包、递送技术和计算设计流程的不断创新，多重编辑在利用植物基因组工程的全部潜力以应对可持续农业、粮食安全、能源独立和气候韧性的挑战方面具有巨大的前景。