综述：多路工程化和多功能T细胞用于精准有效的免疫治疗

《Frontiers in Immunology》：Multiplex engineering and multifunction T cells for precise and effective immunotherapies

本综述系统探讨了通过多重基因编辑和多功能化改造T细胞以提升肿瘤免疫治疗精准性与有效性的前沿策略。文章详细介绍了CRISPR-Cas9、碱基编辑等工具在克服T细胞耗竭、肿瘤抗原逃逸及毒性控制等挑战中的应用，并综述了临床转化进展，为开发新一代细胞疗法提供了重要见解。

　　

1 引言

过继性T细胞转移已成为现代癌症免疫治疗的支柱技术。在CRISPR-Cas9等病毒和非病毒技术推动下，基因工程为新兴细胞疗法及改良成熟方法（如嵌合抗原受体修饰T细胞）提供了新机遇。然而，第一代基因修饰T细胞疗法仍受限于T细胞生物学固有约束，包括T细胞耗竭、向敌对肿瘤床的归巢能力差、毒性作用以及肿瘤抗原逃逸相关挑战。多重基因编辑技术能通过进一步工程化改造显著扩展细胞治疗潜力，目前聚焦于利用现有细胞工程技术对单个T细胞进行多位点基因工程改造和/或赋予多种新功能，以规避癌症过继免疫治疗的缺陷。

2 T细胞工程化方法

多种基因修饰方法可实现外源遗传物质插入基因组或改变特定基因序列。这些技术主要分为两类：非靶向插入遗传物质的方法（病毒载体、转座子等）和靶向基因编辑技术（归巢内切酶、锌指核酸酶、TALEN及CRISPR-Cas9系统）。非病毒方法如电转、纳米颗粒等可实现多种 cargo 的递送。CRISPR-Cas9系统通过向导RNA实现高效多重编辑，但其引起的双链断裂可能导致脱靶突变和染色体易位。碱基编辑和引物编辑技术能实现精确单核苷酸改变而无DNA双链断裂，显著降低基因组重排风险。此外，RNA靶向技术如CRISPR-Cas13可瞬时调控基因表达，表观遗传靶向方法则能改变染色质状态而不永久改变DNA序列。

病毒载体中，慢病毒可转导分裂与非分裂细胞，支持稳定基因表达；腺相关病毒免疫原性低但装载容量小。非病毒方法如睡美人转座子系统成本低且装载量大，但存在半随机整合风险。电转和核转染能高效递送遗传物质至原代T细胞，但可能引起显著细胞毒性。基因编辑时机对安全性和效率至关重要，通常在T细胞激活后24-48小时内进行编辑可减少染色体异常。

基因工程化过程中的基因毒性需重点关注。多重基因编辑可能引起染色体易位、大片段缺失等复杂重排。通过使用高保真Cas9变体、时序分离sgRNA递送、促进同源定向修复等策略可降低风险。质量控制需评估载体拷贝数、全长的转基因整合与表达等参数，并监测长期安全性。

3 多重工程化应对过继T细胞免疫治疗局限

3.1 应对T细胞生物学局限

3.1.1 T细胞功能障碍

T细胞反复抗原暴露会导致终末效应分化、衰老或耗竭。通过基因编辑调控表观遗传机制可影响T细胞命运，例如CRISPR-Cas9失活H3K9三甲基转移酶SUV39H1能促进CAR-T细胞自我更新表型；删除DNMT3A可增强增殖能力和体内持久性。靶向关键转录因子（如NR4A受体、PRDM1）或过表达c-Jun能改善T细胞功能。免疫检查点分子PD-1、LAG-3、TIM-3等的多重编辑可显著恢复T细胞活性，Cas13系统还能实现多重基因敲降。

3.1.2 同种异体反应性与耐药性

同种异体T细胞治疗面临移植物抗宿主病和宿主排斥双重挑战。通过多重编辑同时敲除TRAC、B2M、CIITA等基因可消除TCR-MHC识别功能，降低相关风险。碱基编辑较Cas9核酸酶编辑能减少DNA损伤反应通路激活。此外，编辑糖皮质激素受体或FKBP12可赋予T细胞对糖皮质激素或他克莫司的耐药性；CD52删除可避免阿仑单抗的清除作用；在靶向T细胞恶性肿瘤的CAR-T中删除CD5或CD7可避免 fratricide。

3.2 多功能T细胞精准靶向肿瘤

3.2.1 规避抗原逃逸

单抗原靶向易导致免疫选择耐药变异。多抗原靶向策略包括共输注多特异性T细胞、共表达双特异性CAR（串联CAR）等。例如，在急性髓系白血病中同时表达转基因NPM1特异性TCR和CD33 CAR显示出协同作用。针对B细胞恶性肿瘤，CD19/CD22双重靶向可减少抗原逃逸；多发性骨髓瘤中BCMA与GPRC5D等双靶点策略正在探索中。

3.2.2 肿瘤归巢

实体瘤治疗中T细胞向肿瘤部位归巢效率低是主要障碍。通过工程化改造使T细胞表达特定趋化因子受体（如CCR2、CXCR2、CCR4、CCR6等）可增强向肿瘤微环境的迁移能力。此外，表达细胞外基质降解酶（如乙酰肝素酶、基质金属蛋白酶8）或松弛素-2能改善T细胞在纤维化肿瘤组织中的浸润。

3.2.3 抵抗肿瘤微环境

肿瘤微环境通过代谢产物、抑制性信号等削弱T细胞功能。策略包括：1）通过“装甲”T细胞分泌免疫刺激因子（如IL-12、IL-18）或稳态细胞因子（IL-7、IL-15等）改变微环境；2）使T细胞对抑制信号不敏感（如删除A_2a腺苷受体、TGF-β受体）；3）使用转换受体将抑制信号转为激活信号（如PD-1/CD28、TGFBR/4-1BB开关受体）。微环境特异性激活系统（如缺氧感应CAR、蛋白酶激活CAR）能限制活性至肿瘤局部。

3.3 控制过度毒性

CAR-T细胞疗法常见毒性包括细胞因子释放综合征、免疫效应细胞相关神经毒性综合征、靶向/脱瘤毒性等。安全策略涵盖：可诱导 caspase-9 等自杀开关、消除标志物（截短EGFR、CD20）、逻辑门控CAR（需双抗原激活）、SynNotch受体、抑制性CAR、可调控系统（四环素反应启动子）等。肿瘤微环境选择性表达系统（如缺氧响应元件启动子）能将CAR活性或细胞因子释放限制在肿瘤部位，降低全身毒性。

3.4 整合T细胞与肿瘤生物学

当前已开发出整合多重概念的工程化T细胞产品。例如，基于碱基编辑和CRISPR技术同时敲入CAR转基因并敲除B2M、CD52、TRAC、PD-1等基因，可产生抗排斥、抗耗竭的多功能T细胞。在转基因TCR疗法中，多重编辑TIM-3、LAG-3等检查点分子能增强抗肿瘤功能。模块化基因编辑方法为个性化T细胞产品设计提供了广阔空间。

4 临床中的多重工程化T细胞

目前临床数据主要涉及两大方向：通过编辑免疫检查点基因增强T细胞抗耗竭能力，以及通过编辑组织相容性相关基因降低同种异体反应性。早期研究显示，CRISPR-Cas9和碱基编辑方法在基因毒性方面总体可控，不良反应谱与常规CAR-T细胞相似。然而，同种异体产品持久性可能受限，完全消除MHC I类分子表达可能增强NK细胞介导的排斥。TCR缺失可能影响T细胞稳态，PD-1编辑在某些情况下可能加速T细胞功能障碍。

实体瘤治疗中，多重编辑T细胞策略正在积极探索。临床研究已证实PD-1编辑的自体T细胞和TILs的安全性；新抗原特异性TCR转基因T细胞联合多重编辑显示出初步疗效。多抗原靶向策略在血液肿瘤中取得进展，未来有望应用于实体瘤。尽管挑战巨大，通过整合多重靶向、微环境改造及个性化新抗原策略，实体瘤T细胞治疗前景可期。

5 结论与展望

多重工程化T细胞领域正从多顺反子病毒载体向模块化、多技术平台融合方向发展。基因编辑技术的进步为应对T细胞功能优化、肿瘤逃逸、毒性控制等核心挑战提供了强大工具。未来发展需关注制造工艺创新（如封闭自动化系统、非病毒编辑平台）、质量控制体系优化以及监管框架适应。同时，工程化NK细胞、诱导多能干细胞衍生细胞等新型治疗模式，以及联合多种工程化细胞产品的策略将进一步拓展癌症免疫治疗疆域。尽管挑战犹存，精准化、多功能化的下一代T细胞疗法必将为肿瘤治疗带来新的突破。