鳞杯伞多糖通过调控PI3K/Akt/mTOR通路与肠道菌群改善DSS诱导的小鼠结肠炎

《Food Frontiers》：Clitocybe squamulosa Polysaccharides Ameliorate Dextran Sulfate Sodium-Induced Colitis by Regulating the PI3K/AKt/mTOR Pathway and the Intestinal Flora in Mice

本研究深入探讨了鳞杯伞（Clitocybe squamulosa）子实体多糖（CSFP）及其纯化组分（CE）对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎（UC）的保护作用及机制。研究发现，CSFP和CE不仅能显著缓解临床症状和组织病理损伤，还能增强抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）活性，调节炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10）表达，并强化肠道屏障完整性（上调ZO-1、occludin、claudin-1和MUC2/3）。机制上，二者通过抑制PI3K/Akt/mTOR通路增强自噬相关蛋白（Beclin1、Atg5/7、LC3-II）表达，减少p62积累，同时重塑肠道菌群结构，富集有益菌（Akkermansiaceae、Muribaculaceae、Bifidobacteriaceae、Dubosiella），抑制有害菌（Lachnospiraceae），促进短链脂肪酸（SCFA）生成及其受体（GPR41/43/109A）表达，多途径协同改善结肠炎，为开发功能性食品或营养制剂提供了科学依据。

　　

1 引言

溃疡性结肠炎（UC）是一种慢性炎症性肠病（IBD），以结肠黏膜持续性炎症和溃疡为特征，临床表现为便血、腹泻、腹痛等，严重影响患者生活质量。当前治疗方法如5-氨基水杨酸（5-ASA）、免疫抑制剂等虽能缓解症状，但存在副作用且无法根治。天然活性化合物尤其是多糖类，因具有良好的生物相容性、低副作用及多重生物活性（免疫调节、抗氧化、调节肠道菌群等），在UC治疗中备受关注。蘑菇来源的多糖（如虫草素、木耳多糖等）在实验性结肠炎模型中已显示出通过缓解氧化应激或抑制促炎通路（如NF-κB）发挥保护作用。此外，多糖还能上调紧密连接（TJ）蛋白（如ZO-1、occludin、claudin-1）和黏蛋白（如MUC2/3），并通过肠道菌群发酵产生短链脂肪酸（SCFAs）维持肠道稳态。自噬作为一种进化保守的溶酶体降解途径，在肠道稳态和UC病理中扮演重要角色，增强自噬可能成为缓解结肠炎的新策略。鳞杯伞（Clitocybe squamulosa）是一种生长于中国山西五台山的野生食药用蘑菇，其子实体富含多糖等活性成分。前期研究已建立其多糖（CSFP）的提取纯化方法，并发现其具有免疫调节和改善肠道菌群的作用。本研究旨在评估CSFP及其纯化组分CE对DSS诱导的UC小鼠的保护作用，并从肠道屏障、炎症调节、菌群稳态和自噬活性等多角度阐明其机制。

2 材料与方法

2.1 试剂

DSS购自MP Biomedical，其他试剂包括梅沙拉嗪肠溶片、H&E和AB-PAS染色剂、抗氧化检测试剂盒（CAT、SOD、MDA、GSH-Px、MPO、NO）、ELISA试剂盒（IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α、claudin、occludin、ZO-1）、RNA提取试剂盒、抗体（β-Actin、LC3、P62、Beclin1、Akt、p-Akt、PI3k、p-PI3k、mTOR、p-mTOR）等。

2.2 CSFP的提取与纯化

鳞杯伞子实体粉末按1:30（m:v）比例加水，80℃水浴提取3.6小时，过滤后浓缩，用亚铁氰化钾和乙酸锌溶液脱蛋白，透析后乙醇沉淀，冻干得CSFP。纯化采用DEAE-52柱层析，水洗脱，收集主峰组分CE。

2.3 CE的理化性质分析

分子量通过多角度激光光散射凝胶渗透色谱测定，CE的峰值分子量（M_p）、重均分子量（M_w）和数均分子量（M_n）分别为3453、3296和3321 Da。单糖组成采用离子色谱分析，CE包含岩藻糖、葡萄糖胺、半乳糖、葡萄糖、木糖和甘露糖，摩尔比为0.003:0.004:0.175:0.571:0.007:0.239。FT-IR显示CE具有多糖特征吸收峰（如3404.28 cm^?1处O-H伸缩振动，2931.73 cm^?1处C-H振动）。SEM显示CE呈层状结构，表面平坦光滑。

2.4 动物实验设计

84只雄性C57BL/6J小鼠随机分为7组：正常组（CON）、模型组（DSS）、阳性药组（PC）、低剂量CSFP组（CL）、中剂量CSFP组（CM）、高剂量CSFP组（CH）和CE组。除CON外，其他组饮用3% DSS溶液7天诱导结肠炎。从建模第3天开始，分别灌胃给予CSFP（200、400、800 mg/kg/day）、CE（400 mg/kg/day）、梅沙拉嗪（150 mg/kg/day）或生理盐水。

2.5 生理指标检测

记录体重、摄食量、摄水量、结肠长度、疾病活动指数（DAI）、脾指数和肝指数。DAI评分基于体重减轻、粪便性状和便血程度。

2.6 组织学分析

结肠组织进行H&E和AB-PAS染色，评估炎症、隐窝结构、肌层增厚和杯状细胞丢失情况。

2.7 血清炎症因子测定

ELISA法检测血清中TNF-α、IL-1β和IL-10水平。

2.8 结肠组织指标检测

测定氧化应激指标（CAT、SOD、MDA、GSH-Px、MPO、NO）、炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、MCP-1）和TJ蛋白（ZO-1、claudin、occludin）含量。

2.9 基因表达分析

qRT-PCR检测自噬相关基因（Atg5、Atg7、Beclin1）和炎症因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10、COX-2）的mRNA表达。

2.10 Western blot分析

检测自噬相关蛋白（Beclin1、P62、LC3）和PI3K/Akt/mTOR通路蛋白（p-PI3K、PI3K、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR）的表达。

2.11 16S rRNA测序

提取粪便DNA，对16S rRNA基因V3-V4区进行测序，分析肠道菌群组成。

2.12 SCFAs测定

GC-MS法检测盲肠内容物中SCFAs（乙酸、丙酸、正丁酸、异丁酸、正戊酸、异戊酸）含量。

2.13 统计分析

数据以均值±标准差表示，采用ANOVA进行显著性分析（p < 0.05）。

3 结果

3.1 CE的理化性质

CE分子量较低，单糖以葡萄糖和甘露糖为主，FT-IR和SEM显示其具有典型多糖结构特征。

3.2 CSFP和CE对UC小鼠体征的影响

DSS组小鼠体重下降、摄食摄水减少、结肠缩短、DAI升高，CSFP和CE干预后显著改善，且呈剂量依赖性。

3.3 对组织病理学变化的影响

DSS组出现隐窝结构破坏和炎症细胞浸润，CSFP和CE治疗后损伤减轻，杯状细胞数量恢复。

3.4 对生理指标的影响

3.4.1 血清炎症因子

DSS组TNF-α和IL-1β升高，IL-10降低，CSFP和CE干预后逆转。

3.4.2 氧化应激指标

DSS组抗氧化酶（CAT、SOD、GSH-Px）活性下降，氧化损伤指标（MDA、MPO、NO、iNOS）上升，CSFP和CE治疗后改善。

3.4.3 炎症相关指标

DSS组促炎因子（TNF-α、IL-6、IL-1β、MCP-1、COX-2）表达上调，抗炎因子IL-10下调，CSFP和CE干预后调节至正常水平。

3.4.4 肠道屏障相关指标

DSS组TJ蛋白（ZO-1、occludin）表达下降，claudin上升，黏蛋白（MUC2、MUC3）表达下降，Toll样受体（TLR2、TLR4）上升，CSFP和CE治疗后修复。

3.5 对结肠组织自噬水平的影响

3.5.1 自噬相关基因表达

DSS组Atg5、Atg7、Beclin1表达抑制，CSFP和CE干预后上调。

3.5.2 自噬相关蛋白表达

Western blot显示DSS组Beclin1和LC3-II/LC3-I下降，P62积累，CSFP和CE治疗后逆转。

3.5.3 PI3K/Akt/mTOR通路表达

DSS组p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值升高，CSFP和CE抑制其磷酸化。

3.6 对肠道菌群的影响

3.6.1 菌群组成

DSS组菌群多样性下降，有害菌（如变形菌门、脱硫杆菌门）增多，有益菌（如Muribaculaceae、Akkermansiaceae、Bifidobacteriaceae、Dubosiella）减少。CSFP和CE干预后菌群结构改善，有益菌富集。

3.6.2 菌群代谢产物

DSS组SCFAs含量下降，CSFP和CE干预后升高，并上调SCFA受体（GPR41、GPR43、GPR109A）表达。

4 讨论

本研究证实CSFP和CE通过多途径缓解DSS诱导的结肠炎。其机制包括：①增强抗氧化酶活性，减轻氧化应激；②调节炎症因子平衡，抑制过度炎症反应；③上调TJ蛋白和黏蛋白，修复肠道屏障；④抑制PI3K/Akt/mTOR通路，促进自噬，清除受损细胞器；⑤重塑肠道菌群，富集有益菌，抑制有害菌，促进SCFAs生成。其中，CE因含岩藻糖，可能通过促进Akkermansia等有益菌生长，增强屏障功能。这些发现为鳞杯伞多糖作为功能性食品或药物开发提供了理论依据。

5 结论

CSFP和CE通过调节PI3K/Akt/mTOR通路增强自噬、重塑肠道菌群、减轻炎症和氧化应激、修复肠道屏障，多靶点改善UC。未来需进一步明确其与肠道细胞表面受体的相互作用机制。