综述：细菌-噬菌体相互作用中的军备竞赛：通过宏基因组学解析细菌防御与噬菌体反防御机制

《Frontiers in Microbiology》：The arms race in bacteria-phage interaction: deciphering bacteria defense and phage anti-defense mechanisms through metagenomics

本综述系统梳理了细菌与噬菌体在长期共进化中形成的复杂防御（如CRISPR-Cas、RM系统）与反防御机制（如Anti-CRISPR蛋白），强调宏基因组学技术在揭示其相互作用中的关键作用，为理解微生物生态、进化及开发新型抗菌策略（如噬菌体疗法）提供了重要视角。

　　

在微生物世界的隐秘战场上，一场持续了数十亿年的军备竞赛正在悄然进行——细菌与专性感染它们的病毒“捕食者”噬菌体之间，通过无尽的攻防博弈共同塑造着生命的进化轨迹。这场竞赛不仅驱动了微生物多样性的产生与维持，更在抗生素耐药性危机日益严峻的今天，为开发新型抗菌策略提供了无限灵感。

1 引言

作为能够特异性感染并裂解病原菌的病毒，噬菌体以其高特异性成为对抗抗生素耐药性感染的潜在替代方案。然而，由于噬菌体与其细菌宿主之间永无休止的共进化军备竞赛，病原菌对噬菌体疗法的耐药性频频出现。尽管临床噬菌体疗法已采用多噬菌体鸡尾酒等策略来减缓耐药性，但这些方法仍显不足。因此，深入理解噬菌体与宿主细菌之间相互作用的底层机制至关重要。

在长期的共进化过程中，噬菌体对细菌种群施加了强大的选择压力，驱使细菌发展出复杂的免疫系统以抵抗或逃避噬菌体感染。这些系统共同定义了细菌免疫——即细菌通过精确调控的机制，在环境压力下维持细胞完整性并确保生存的能力。随着分子技术的快速发展，高通量宏基因组测序已成为一种强大工具。该技术无需纯化、分离或培养，即可直接对环境样本中的所有微生物及其基因组进行测序和分析。与传统培养方法相比，它具有更高的灵敏度和准确性，有助于快速鉴定新微生物物种，并揭示了微生物生态系统的前所未有的图景。因此，宏基因组测序为研究噬菌体-细菌相互作用提供了一种新颖而有效的途径。

2 噬菌体特异性调控细菌宿主

噬菌体在自然环境中无处不在，凡是存在细菌宿主的地方都能检测到它们，这使其成为塑造微生物群落组成的主要力量。根据生命周期，噬菌体可分为慢性、裂解性和溶原性三种类型。噬菌体特异性附着于细菌表面的受体，并将其遗传物质注入宿主细胞，然后利用宿主来源的酶复制其遗传物质并产生子代噬菌体。

在裂解周期中，噬菌体在将核酸注入宿主细胞后，迅速合成早期蛋白以降解宿主的遗传物质并劫持细胞过程，然后利用宿主的细胞机器合成组装新噬菌体颗粒所需的剩余结构蛋白，新复制的遗传物质被包装进病毒粒子内。在整个裂解过程中，噬菌体编码的酶逐步降解宿主细胞，最终导致其裂解并将子代噬菌体释放到环境中。在溶原周期中，噬菌体通过其编码的整合酶将其遗传物质整合到宿主基因组中，而不是杀死宿主。整合的噬菌体基因组随后与宿主基因组一起被动复制。

尽管成熟的实验室模型准确地描述了这三种感染周期中的噬菌体复制，但越来越多的证据表明，这些模型可能无法完全捕捉自然环境中噬菌体-细菌相互作用的复杂性。噬菌体通过多种机制与细菌宿主相互作用并对其产生显著影响。最普遍的机制是调节宿主细菌的组成和丰度，从而影响细菌群落的多样性。噬菌体不仅是细菌种群组成的改变者，更是细菌进化的重要驱动力。这种进化压力源于噬菌体通过其捕食行为以及通过溶原化、转导和宿主基因破坏等机制整合到细菌基因组中作为原噬菌体的能力所施加的强烈选择力。

溶原性噬菌体可以通过整合到细菌基因组中直接影响宿主进化。一些噬菌体整合到特定位点，干扰极小，甚至可能赋予对其它噬菌体重复感染的免疫力。此类原噬菌体编码的保护机制在自然界中似乎很普遍。噬菌体还通过水平基因转移驱动细菌宿主种群的进化。作为水平基因转移的载体，噬菌体通过普遍性转导和特异性转导介导基因交换。

3 噬菌体与细菌的相互作用

进化生物学家Leigh van Valen著名的“红皇后假说”指出，物种必须不断适应和进化才能生存并将遗传物质传递给后代。在自然生态系统中，噬菌体与细菌之间的相互作用正是这种紧密耦合的共进化关系的例证。一方的变化常常驱动另一方发生相应变化甚至灭绝。因此，相互适应和共同进化对于生存至关重要。

为了防御噬菌体感染，细菌进化出了多种免疫系统，在噬菌体生命周期的各个阶段抵抗噬菌体入侵。可以预见的是，噬菌体也进化出了克服这些防御的对策。这种动态，加上噬菌体的巨大多样性，共同驱动了细菌免疫机制的进化。因此，细菌和噬菌体分别进化成更具抗性（即能够抵抗更广泛噬菌体基因型）和更具感染性（即能够感染更多细菌基因型）的形式。这种进化模式通常被称为“军备竞赛”。

噬菌体要成功感染细菌细胞，必须首先与细菌表面的受体蛋白结合以完成吸附，随后破坏细菌膜以注入其基因组。为了阻止噬菌体吸附，细菌可能会修饰或掩盖其表面受体。尽管细菌表面受体发生此类修饰或突变，一些噬菌体仍能成功注入其遗传物质。因此，细菌进化出了额外的先天免疫系统来检测和降解入侵的噬菌体核酸。

限制性修饰系统是表征最清楚的抗噬菌体先天免疫机制之一。它通常由甲基转移酶和限制性内切酶组成。甲基转移酶识别特定的DNA序列并使其甲基化，而限制性内切酶则在这些位点切割未甲基化的DNA。细菌利用RM系统降解入侵噬菌体的核酸，作为主要的防御机制。作为对策，噬菌体进化出了多种策略来逃避这种宿主介导的降解。

此外，细菌还进化出了被称为CRISPR-Cas系统的适应性免疫系统来抵抗噬菌体入侵。CRISPR-Cas免疫存在于约40%的已测序细菌基因组中，通过三个不同的阶段介导对噬菌体的抗性：适应、表达和干扰。迄今为止，已鉴定出两个主要类别、六种类型和超过30个亚型的CRISPR-Cas系统。反过来，噬菌体也进化出了对抗细菌适应性免疫的机制。在一些噬菌体中发现了抗CRISPR蛋白，它们抑制CRISPR-Cas系统的活性——这是迄今为止表征的最广泛的天然蛋白质抑制剂家族之一，超过90个家族采用不同的分子机制。

如果噬菌体成功绕过RM和CRISPR-Cas防御系统，细菌可能会激活流产感染系统作为最后的防御策略。该系统触发细胞停滞或程序性细胞死亡，从而停止噬菌体复制周期，限制其传播，并保护更广泛的细菌种群。

总体而言，细菌与噬菌体之间的相互作用是微生物群落生态和进化的核心。这种相互作用是一个复杂而动态的过程，以持续的进化军备竞赛为特征。细菌对噬菌体的免疫防御涉及多种机制的协同作用。细菌首先采用被动免疫来抑制噬菌体吸附并阻断噬菌体DNA的进入。随后，主动免疫系统（如RM系统和CRISPR-Cas系统）干扰噬菌体DNA复制和基因表达。此外，流产感染代表了一种更高层次的利他防御策略，受感染的细菌细胞在噬菌体复制周期完成之前进行程序性自我毁灭，从而防止病毒传播并保护种群内邻近细胞的生存。另一方面，噬菌体也制定了相应的策略来克服细菌防御。通常，噬菌体表现出比其细菌宿主更高的突变率，这赋予了它们显著的进化优势。

4 噬菌体-细菌相互作用的序列组成特征

高通量宏基因组测序技术的进步使得无需培养即可直接从环境样本中鉴定噬菌体及其宿主，为全面研究噬菌体-细菌相互作用提供了强大工具。病毒宏基因组学的分析工作流程包括以下关键步骤：① 原始测序数据的质量控制和预处理；② 病毒宏基因组序列的从头组装；③ 使用重叠群长度、覆盖深度和完整性等指标评估组装质量；④ 识别病毒样序列，然后进行分类学分类和功能注释；⑤ 系统发育分析和宿主细菌预测。

抗CRISPR蛋白的发现源于对表现出对I-F型CRISPR-Cas系统敏感性与抗性的噬菌体的比较基因组分析。基因组相似性有助于识别导致不同表型的关键遗传差异，从而实现靶向候选基因的发现。这种系统化的流程能够全面表征复杂环境中的病毒群落及其功能潜力。幸运的是，在噬菌体与细菌的共进化过程中，留下了各种基因组信号，可用于推断潜在的宿主-噬菌体关系。

噬菌体和细菌的丰度模式反映了它们的生态关系。噬菌体及其细菌宿主的基因组表现出时间和空间上的相关性，这不仅适用于整合到宿主基因组中的溶原性噬菌体，也适用于依赖宿主进行复制的裂解性噬菌体。序列相似性搜索是识别遗传同源性并基于基因组序列预测噬菌体与其细菌宿主之间关联的最直接方法。这些同源序列可能反映了噬菌体在先前感染事件中获取了细菌DNA。

在细菌和古菌中，翻译选择偏爱最优密码子以实现高效的基因表达。由于病毒复制依赖于宿主的翻译机器，利用类宿主密码子或tRNA同工酶的噬菌体可以提高噬菌体基因翻译的效率，这有利于病毒复制。一些噬菌体还编码tRNA基因来改变其宿主的密码子使用偏好。此外，噬菌体使用的寡核苷酸频率模式可能由避免宿主限制性内切酶识别位点的进化压力所塑造。因此，可以通过寡核苷酸频率谱的相似性将噬菌体与其细菌宿主联系起来。

分子和生态水平上的共进化过程塑造了噬菌体和细菌的基因组。噬菌体与其宿主之间的初始相互作用涉及噬菌体颗粒与细菌细胞表面特定受体分子的结合。将基因组注入宿主细胞后，噬菌体必须劫持宿主代谢以支持有效的噬菌体生产。为了实现这一目标，噬菌体进化出了特定的蛋白质，这些蛋白质与宿主蛋白质相互作用以抑制、激活或重定向其功能，从而操纵宿主细胞机器以产生新的噬菌体后代。利用宏基因组学，研究人员发现CRISPR系统广泛编码于多种噬菌体中，它们作为高度多样化和超紧凑的抗病毒防御机制发挥作用。然而，目前测序的噬菌体基因中约70%编码功能未知的蛋白质，并且只有有限数量的噬菌体就其与宿主蛋白质的分子相互作用进行了系统研究。因此，识别和表征参与噬菌体-宿主相互作用的蛋白质-蛋白质或结构域-结构域相互作用仍然是一个重大挑战。

5 结论与展望

通过与噬菌体的长期进化斗争，细菌发展出了复杂的免疫系统，共同增强了其生存能力。大规模基因组和宏基因组测序技术的进步极大地推动了利用生物信息学方法理解细菌-噬菌体相互作用机制。通过将生物信息学与分子生物学、微生物学和补充性实验方法相结合，研究人员已经鉴定出一系列新型的细菌抗噬菌体防御系统，显著增进了我们对噬菌体-细菌相互作用的理解。尽管取得了这些进展，研究中仍然存在一些挑战，特别是在将组学数据与实验验证相结合的必要性方面。这些挑战代表了未来研究的重要方向：

尽管宿主预测本质上是任何病毒组分析流程的关键组成部分，并且在过去十年中一直是广泛研究和工具开发的重点，但计算上将未培养病毒与其细菌宿主联系起来仍然是一个重大挑战。

尽管在表征个体免疫机制方面取得了显著进展，但我们对于这些机制如何相互作用和协调的理解仍然有限。目前尚不清楚在噬菌体感染期间，是单一机制独立起作用，还是多种机制顺序或并行运作。

噬菌体的高度多样性增加了研究细菌免疫的复杂性。需要进一步研究以探索同一细菌物种在面对相同或不同噬菌体时，如何在不同的免疫机制中进行选择，以及免疫反应敏感性的可变性。

随着大规模数据集的日益增多，越来越需要应用人工智能方法来揭示细菌-噬菌体相互作用中的潜在关联，并提高预测算法的准确性。将AlphaFold等AI工具应用于预测噬菌体蛋白质的新功能，已经导致发现了先前未知的噬菌体免疫逃逸机制。