哺乳动物线粒体DNA甲基化与羟甲基化酶活性的功能机制研究

《Frontiers in Cell and Developmental Biology》：Cytosine methylase and hydroxymethylase activity in mammalian mitochondria

本综述系统阐述了哺乳动物线粒体中胞嘧啶甲基转移酶（mtDNMT1, DNMT3b）和羟甲基化酶（TET-like）的活性及其功能。研究证实mtDNMT1与DNMT3b协同调控线粒体DNA（mtDNA）甲基化，而TET2样活性负责5mC向5hmC的转化。值得注意的是，线粒体启动子区（HSP/LSP）的甲基化呈现与核内相反的转录激活作用，揭示了线粒体表观遗传调控的新模式，为理解线粒体功能异常相关疾病提供了新视角。

　　

引言

线粒体作为真核细胞的能量工厂，不仅承担着能量代谢的核心角色，还是多种信号通路的关键调节者。这些独特的细胞器保留并表达着自身的DNA——线粒体DNA（mtDNA）。mtDNA被包装成DNA-蛋白质复合物，即核样体（nucleoids），并且同样受到表观遗传修饰的调控。尽管此前研究在线粒体中鉴定出了DNA甲基转移酶1（DNMT1）的线粒体亚型（mtDNMT1），该亚型能够与mtDNA的关键调控区域结合，但其酶活性一直未被探索。

结果

2.1 mtDNMT1和DNMT3b（而非DNMT3a）在线粒体中具有催化活性

研究团队通过同源重组技术在HCT116细胞中构建了内源性C端带有串联亲和纯化（TAP）标签的DNMT1细胞系（HCT-TAP）。细胞分馏和免疫印迹分析证实，DNMT1-TAP定位于线粒体区室。线粒体DNA免疫共沉淀（mtIP）分析显示，DNMT1-TAP直接结合mtDNA，且结合频率与CpG密度成正比，并定位于不溶性的mtDNA核样体部分，证明了其位于线粒体基质内。

研究人员采用基于荧光信号的GlaI切割法，检测从细胞线粒体组分中纯化的mtDNMT1-TAP的甲基转移酶活性。该检测依赖于一种独特的断裂发光寡核苷酸，其5'端标记有FAM荧光基团，3'端标记有dabcyl淬灭基团。该寡核苷酸形成发夹结构，使荧光基团和淬灭基团紧密靠近，从而抑制荧光。在发夹的茎部含有四个对称的CpG位点，可以是半甲基化（Oligo 1）或完全甲基化（Oligo 2）。当完全四甲基化时，该寡核苷酸成为甲基化敏感性限制性内切酶GlaI的最佳底物。GlaI的切割会释放荧光基团，产生与CpG甲基化程度成正比的荧光增强信号。

从HCT-TAP细胞中分离线粒体，用胰蛋白酶消化完整的线粒体沉淀以降解任何可能污染线粒体外膜的蛋白质。线粒体裂解后，通过亲和纯化获得mtDNMT1-TAP。将不同量的纯化mtDNMT1-TAP与240 nM Oligo 1、1 mM S-腺苷甲硫氨酸（SAM）和0.8U GlaI共同孵育，以随时间测量其甲基化活性。结果表明，纯化的mtDNMT1-TAP表现出CpG特异性的DNA甲基转移酶活性，该活性随时间呈线性关系，并且当相对于酶浓度作图时，遵循经典的米氏动力学。该活性明显高于煮沸的mtDNMT1-TAP（阴性）对照，并且其在 mitochondrial lysis 前对胰蛋白酶消化的抵抗性验证了其确实来源于线粒体区室内部。

为了探究de novo甲基转移酶是否也参与线粒体DNA甲基化，研究使用了携带催化性缺失的不同DNMT的胚胎干细胞（ES）系。从各细胞系中分离出高纯度的线粒体组分，并使用灵敏的荧光ELISA-like法检测总DNA甲基转移酶活性。缺乏DNMT1（DNMT1^c/c）或DNMT3b的细胞，其线粒体DNMT活性相对于野生型（WT）对照显著降低。缺乏所有三种DNMT的三重敲除（TKO）细胞，其线粒体甲基化水平处于基线/背景水平。值得注意的是，单独缺失DNMT3a对线粒体区室来源的总DNMT活性没有影响，表明DNMT3a不参与mtDNA的甲基化。这些数据提示，mtDNMT1和DNMT3b在线粒体中存在功能协作，类似于它们在细胞核中的相互关系。

2.2 线粒体中检测到TET样DNA羟甲基化酶活性和TET2

在确认线粒体中存在DNA甲基转移酶活性后，研究转向探索mtDNA中5hmC生成的机制，重点关注TET介导的5mC氧化。研究人员采用in vitro斑点印迹法检测纯化线粒体中的TET酶活性。简言之，将变性的底物DNA（100 ng甲基化的人APC启动子序列）与纯化的线粒体裂解液（作为潜在的TET酶来源）一起孵育。TET酶反应在37°C下进行0-1小时，并在冰上淬灭终止。含有转化后的5hmC残基的反应产物被点到吸收膜上，并用5hmC特异性抗体进行探测。通过化学发光检测产生的5hmC信号，并通过光密度法进行定量。

在阳性对照反应中，将未甲基化（Un）、甲基化（5mC）和羟甲基化（5hmC）的DNA点样到膜上，以确定5hmC抗体的特异性，该抗体可检测到低至200个胞嘧啶残基中有一个5hmC的水平。使用重组TET1 C端结构域（TET1-CTD）作为酶活性的阳性对照。阴性对照包括在底物DNA孵育前将线粒体裂解液煮沸10分钟以消除任何TET酶活性，以及不加入底物DNA的单独反应。从WT HCT116细胞中分离出完整的线粒体，并进行胰蛋白酶消化以消除任何污染的外膜结合的胞质或核蛋白。免疫印迹证实线粒体裂解液无核污染。结果显示，在胰蛋白酶处理过的线粒体裂解液中检测到了TET酶活性，其水平高于无底物和煮沸酶对照。煮沸对照中的背景信号代表了mtDNA中内源性的5hmC，而无底物孔中的背景信号则表明酶依赖性地催化了mtDNA中内源性的5mC。这首次报道了来源于线粒体区室内部的羟甲基化酶活性，并为mtDNA中5hmC的生成提供了直接机制。

关于是哪种羟甲基化酶负责此活性，免疫印迹分析发现，TET1的免疫反应性在模拟/未处理的线粒体提取物中可检测到，但该信号对完整线粒体的胰蛋白酶消化敏感，表明TET1仅结合于线粒体外膜，并未进入线粒体内部区室。然而，在模拟和胰蛋白酶处理的线粒体提取物中均检测到TET2的免疫反应性，支持TET2存在于该细胞器中。考虑到DNMT1被报道可能具有催化胞嘧啶直接羟甲基化形成5hmC的活性，以及线粒体中作为呼吸副产物的活性氧化中间体的丰度，研究人员检验了mtDNMT1是否在线粒体中表现出替代性氧化酶活性。在鼠ES细胞中基因删除DNMT1后，甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）分析检测到跨mtDNA的12S和16S rRNA区域的5mC水平如预期般降低，在DNMT1^-/- ES细胞中降至WT水平的约35%。值得注意的是，对相同细胞进行的羟甲基化MeDIP（hydroxy-MeDIP）显示，在缺失一个或两个DNMT1等位基因后，5hmC水平呈阶梯式增加。这些发现与用DNMT抑制剂地西他滨处理细胞后检测到5hmC水平升高的其他研究一致，进一步支持了mtDNMT1不在线粒体中产生5hmC的结论。综合来看，这些数据表明TET2很可能是in vitro酶测定中检测到的羟甲基化酶活性的来源，并负责将mtDNA中的5mC转化为5hmC残基。

2.3 mtDNMT1过表达增加重链胞嘧啶甲基化和线粒体转录

先前研究表明，p53缺失会显著上调mtDNMT1的表达。本研究探讨了mtDNMT1表达变化如何影响mtDNA关键调控区域的甲基化水平。通过MeDIP和hydroxy-MeDIP分析从HCT116 p53^+/+和p53^-/-细胞中纯化的基因组DNA。在p53缺失/mtDNMT1上调后，观察到跨重链和轻链启动子（HSP和LSP）的5mC和5hmC残基丰度增加了约2倍。负责协调高水平rRNA转录物产生的mTERF结合位点也显示出5mC和5hmC水平的增加，尽管12S rRNA和16S rRNA均未显示显著差异。有趣的是，16S rRNA基因内一段不含CpG的区域（“No CpG”）显示出甲基化胞嘧啶残基的显著增加，这似乎是由增加的mtDNMT1催化的，可归因于非CpG甲基化，已知这在mtDNA中普遍存在。甲基化水平最显著的变化似乎是以位点特异性方式发生的，位于mtDNA内的关键调控区域附近，包括HSP和LSP以及包含在LSP扩增子内的重链复制起点（OriH）。

为了探究启动子周围5mC的增加是否影响线粒体转录，研究采用了一种独特的链特异性引物策略来生成多顺反子线粒体cDNA，旨在更准确地模拟天然线粒体新生转录物的产生。使用重叠ATP6基因内区域的正义和反义引物，分别合成重链和轻链的cDNA。作为上样和核基因对照，同时用随机六聚体合成cDNA。观察到重链编码的NADH脱氢酶1（MT-ND1, ND1）和细胞色素c氧化酶亚基1（MT-CO1, Cox1）的转录增加了2-3倍，这些基因位于转录终止（mTERF）位点的下游。未检测到12S rRNA丰度的显著变化，而16S rRNA转录水平略有下降。轻链转录物的丰度显示出类似的不一致性，在mtDNMT1上调后，与ND4和ND5互补的轻链表达增加，而ND6水平下降，表明mtDNA甲基化以基因特异性方式调控线粒体转录。由于p53也被报道定位于线粒体并影响线粒体输出，研究采用了正交方法以消除p53缺失对线粒体转录的潜在混杂效应，更清晰地界定mtDNA甲基化对线粒体功能的影响。

2.4 基因敲除mtDNMT1和/或DNMT3b活性降低D-loop控制区的胞嘧啶甲基化

研究利用CRISPR/Cas9基因组编辑技术，在HCT116 WT和3bKO亲本细胞系中破坏了mtDNMT1的线粒体靶向序列（MTS）。单向导RNA（sgRNA）被策略性地放置在线粒体和核DNMT1翻译起始位点之间，目的是在MTS内引导Cas9切割，破坏mtDNMT1亚型而不影响核DNMT1的表达。将gRNA和Cas9表达质粒转染到WT和3bKO HCT116细胞中，并用嘌呤霉素进行筛选。采用SURVEYOR核酸酶检测法鉴定携带插入缺失突变（indel）的克隆，并通过广泛测序揭示其特定基因型。筛选出的克隆在mtDNMT1 MTS内携带10-31bp的缺失，这造成了移码突变，废除了线粒体起始密码子（ATG），并在核DNMT1的转录起始位点上游产生了一个新的终止密码子。MitoProtII算法预测，编辑后的MTS定位到线粒体的概率仅为2%–3%，而WT mtDNMT1序列的线粒体易位概率为99%。这些HCT基因组编辑（HCT-GE）细胞增殖正常，形态与其WT和3bKO祖细胞系相似。

对亲本和基因组编辑细胞系的亚细胞组分进行免疫印迹分析，证实了mt1KO和3bKO/mt1KO细胞系中线粒体DNMT1表达的降低。在HCT-GE细胞的线粒体裂解液中观察到轻微的残留mtDNMT1表达，这表明除了MTS引导其线粒体易位外，DNMT1也可能被伴侣蛋白带入基质。正如预期，在3bKO和3bKO/mt1KO细胞系的全细胞裂解液中缺乏DNMT3b，证实了其基因敲除。支持先前的观察结果，本研究使用的DNMT3b抗体在任何细胞系的线粒体提取物中均未检测到全长DNMT3b；相反，检测到一个40 kDa的免疫反应条带，被认为是DNMT3b进入线粒体后加工的蛋白水解片段，尽管其确切身份尚未确认。有趣的是，3bKO细胞系中总DNMT1水平增加，支持了这些酶之间存在协调调控。TFAM表达在所有HCT-GE细胞系中保持不变，在此用作线粒体上样对照。修饰的组蛋白抗体（H3K4me³）用作核污染对照，仅在WT全细胞裂解液中检测到，证明了线粒体裂解液制备物的纯度。

MeDIP分析证实，在从WT和3bKO亲本细胞中顺序删除mtDNMT1后，跨LSP和更显著的跨HSP的5mC水平呈阶梯式下降。一个不含CpG的mtDNA区域（“No CpG”）用作非甲基化对照，产生的信号极低，表明该扩增子内没有5mC修饰。令人惊讶的是，在删除线粒体DNMT后，跨mTERF结合位点的甲基化增加了，尽管这些差异未达到统计学显著性。轻链复制起点（OriL）相对于mtDNA其余部分CpG较丰富（在仅227bp的片段中含有8个CpG二核苷酸），因此预期当读取同一qPCR标准曲线时，该区域内甲基化胞嘧啶的总体富集度会高于mtDNA基因组的其他区域。然而，WT HCT116细胞中5mC的相对丰度比跨HSP和LSP启动子区域低约5倍，表明OriL处的低水平甲基化可能是轻链复制所必需的。

此外，对缺乏一个或两个DNMT1等位基因（DNMT1^+/?和DNMT1^?/?）的小鼠ES细胞进行的MeDIP分析显示，跨12S和16S rRNA区域的5mC水平显著降低。这些数据共同证实，基因敲除DNMT1和/或DNMT3b在mtDNA的关键调控区域产生了可测量的胞嘧啶甲基化差异，并促使研究人员将这些细胞系用于线粒体功能研究。

2.5 甲基化缺失导致mtDNA含量适度减少和线粒体转录急剧下降

为了精确量化线粒体甲基化对mtDNA拷贝数的潜在影响，采用了高灵敏度的微滴式数字PCR（ddPCR）方法。从HCT-GE细胞中分离的总基因组DNA用作ddPCR的模板，以确定mtDNA（使用MT-CO1/Cox1引物测量）相对于核DNA上样对照（β-珠蛋白）的绝对定量。观察到随着每次复合的基因损伤，mtDNA拷贝数出现小幅阶梯式下降，3bKO/mt1KO细胞与WT细胞相比显示出显著的25%的减少。与传统qPCR进行头对头比较发现，ddPCR在确定细胞系mtDNA拷贝数方面更优，具有更高的精度和更少的技术重复间变异。两种方法都显示出相同的阶梯式趋势，即在基因缺失mtDNMT1和/或DNMT3b后，mtDNA含量适度减少，证实了胞嘧啶甲基化在调控mtDNA复制中的作用。

使用上述相同的引物策略合成多顺反子线粒体cDNA，以探究线粒体DNMT缺失对转录的影响。在缺失mtDNMT1和/或DNMT3b后，线粒体转录受到 dramatically 影响。在缺乏mtDNMT1的细胞中，我们看到mtDNA编码的OXPHOS基因的转录减少了25%–40%，包括重链上的ND1和Cox1，以及轻链上的ND6。DNMT3b的基因敲除导致这些基因的转录显著减少50%–60%，而mtDNMT1的复合缺失（在3bKO/mt1KO细胞中）甚至进一步将线粒体转录降低至仅WT水平的35%–40%。此外，即使在考虑了观察到的mtDNA含量差异后，线粒体转录的差异仍然具有统计学显著性（约比WT减少50%）。因此，甲基化介导的对线粒体转录的影响并不仅仅是由于DNA模板的减少，表明对转录和复制机制的影响是独立的。

讨论

本研究通过严谨的遗传学和创新的技术方法，证实了mtDNMT1具有催化活性，并且似乎与DNMT3b协作甲基化mtDNA。这种协作关系首先在使用来自携带三种催化活性DNMT各自催化缺失以及三者组合缺失的小鼠胚胎干细胞的线粒体提取物中观察到：酶测定显示DNMT1和DNMT3b都对总线粒体甲基化活性有明确贡献，而DNMT3a则没有。在基因组编辑的HCT116细胞家族中证实了DNMT3b对mtDNA甲基化的实质性贡献，其中DNMT3b外显子2-21的缺失导致线粒体甲基化酶活性降低、mtDNA 5mC水平协调性下降以及线粒体转录的惊人减少，所有这些都支持DNMT3b在mtDNA主动甲基化和线粒体转录调控中的作用。在3bKO HCT116细胞中额外删除mtDNMT1甚至进一步加剧了mtDNA低甲基化的效应，表现为mtDNA拷贝数和线粒体转录的显著减少。这些在正常和癌细胞背景以及跨人和小鼠物种的发现表明，mtDNMT1和DNMT3b在线粒体中存在功能协作，可能类似于它们在细胞核中的任务。

本研究直接测量了来源于高纯度线粒体内部的TET样羟甲基化酶活性，证明主动DNA去甲基化的酶促机制在线粒体基质中存在且具有功能。尽管在TET1编码序列上游鉴定到一个具有高线粒体易位概率的推定MTS，但并未观察到TET1进入线粒体区室。然而，免疫印迹检测到HeLa细胞中线粒体定位的TET2，且其对胰蛋白酶消化具有抵抗性，表明其受到细胞器的保护。这一发现使研究人员预测线粒体5hmC的产生要么通过TET2氧化5mC，要么通过其他尚未确定的机制。

一些机制研究检验了改变mtDNA甲基化的功能影响；有些结论认为增加线粒体5mC水平，特别是在置换环（D-loop）控制区，会对转录产生负面影响。这些发现与细胞核内表观遗传调控的范式一致。然而，mtDNA具有与细胞核内线性染色体截然不同的特征。除了缺乏组蛋白外，mtDNA序列不包含CpG岛启动子；相反，HSP和LSP表现出与线粒体基因组其余部分大致相同的CpG密度（～2.6–4.3%）。总体而言，mtDNA表现出CpG抑制，并且CpG稀疏，整个人类线粒体基因组16.5 kb中只有433个CpG。这些独特特征促使研究人员探究mtDNA的表观遗传修饰是否可能具有独特的功能后果。非常引人注目的是，数据提示了一种线粒体表观遗传调控的新模式，即线粒体启动子内部/周围增加的5mC在转录中扮演激活角色。最近Dostal等人发表的in vitro测定表明，mtDNA启动子区域的高甲基化通过加强特定TFAM在转录起始位点的结合来增加线粒体转录。使用来自活细胞提取物的in vivo数据支持这样一种机制，即增加HSP处的5mC增强了转录，相应地，减少跨HSP和LSP的5mC dramatically 降低了两条链的转录。

研究强调了量化线粒体基因表达方法的关键差异。本研究描述了一种独特的链特异性引物策略，分别生成轻链或重链线粒体cDNA。与定量随机六聚体引物cDNA的传统方法不同，后者取两条链转录水平的平均值，链特异性引物方法更准确地模拟了新生多顺反子线粒体RNA的双向合成，并有可能揭示线粒体转录中更大的潜在差异。

DNMT1对于细胞存活至关重要，这一特性使其成为极其重要的关注靶点，但也使研究其功能复杂化。研究团队生成了特异性删除DNMT1 MTS的一组细胞系，目的是废除仅线粒体DNMT1活性，而不影响核亚型。似乎在CRISPR靶向的mtDNMT1KO亚克隆中显著降低但未完全消除mtDNMT1KO表达和酶活性，表明线粒体中的DNMT1活性可能也对细胞存活至关重要。值得注意的是，即使mtDNMT1的适度减少也会导致线粒体功能的严重破坏：5mC水平、mtDNA转录和复制。

进一步支持DNMT1在线粒体中重要作用的是，在纯化的HCT-GE细胞线粒体提取物中存在残留的DNMT1。这提出了DNMT1可能被伴侣蛋白带入线粒体的可能性，无论其MTS是否功能正常。几种热休克蛋白家族成员已被鉴定为分子伴侣，参与稳定 destined for 线粒体的核蛋白，并协助其在输入后重新折叠。另一种将蛋白质靶向线粒体的非常规模式涉及与其他细胞器（如ER）膜的联系位点，通常称为线粒体相关膜（MAMs）。因此，邻近细胞器之间的紧密协作促进了蛋白质和代谢物的交换。mtDNMT1是否利用替代机制进行线粒体输入仍是一个有待进一步研究的问题。

除了其作为维持性DNA甲基转移酶的明确角色外，DNMT1也被观察到结合特定的mRNA转录物，并通过m⁵C RNA甲基化增强相关基因的稳定性。有趣的是，许多DNMT1结合的mRNA与代谢调控和线粒体稳态有关，这构成了DNMT1与线粒体功能之间的额外联系。虽然当前研究的重点是DNMT1介导的mtDNA甲基化，但DNMT1通过RNA水平表观遗传修饰影响线粒体功能的可能性将成为未来研究的一个有吸引力的主题。

尽管绝大多数哺乳动物胞嘧啶甲基化发生在CpG二核苷酸背景下，但几份报告已鉴定出相当水平的非CpG甲基化，发生在CpA、CpC或CpT位点，这些位点在大脑发育过程中积累。最近的证据表明，mtDNA也含有非CpG甲基化，其水平可能超过CpG甲基化。研究考虑了非CpG甲基化的意义。虽然MeDIP测定中使用的抗体对5mC或5hmC修饰具有特异性，没有可测量的交叉反应性，但它们不区分不同二核苷酸背景下发生的5mC。因此，很可能在MeDIP分析中检测到的部分胞嘧啶甲基化可归因于非CpG甲基化。这可能解释了当mtDNMT1上调（p53^?/?）相对于对照（p53^+/+）时，在HCT116细胞中跨“No CpG”扩增子检测到的5mC和5hmC水平的显著差异。de novoDNMTs（DNMT3a和3b）已被证明在非CpG背景下催化胞嘧啶甲基化，表明mtDNA中的5mC修饰可能通过线粒体中的DNMT3b活性产生。无论二核苷酸背景如何，数据清楚地表明，在基因破坏mtDNMTs后，总线粒体甲基化谱发生了改变，并且这些表观遗传变化影响了线粒体功能核心的过程。

线粒体转录功能仅维持在WT水平的25%–60%，预计mt1KO和3bKO/mt1KO细胞会表现出严重的代谢缺陷，这是由于未能合成呼吸链复合体必需的mtDNA编码亚基。研究观察到线粒体基因ND1和ND6（其蛋白质形成复合物I的亚基）以及Cox I（电子传递链ETC复合物IV的亚基）表达的显著减少。mtDNA编码的ETC组分的化学计量失衡已被证明会导致线粒体呼吸受损和代谢重塑，从而诱导氧化应激并导致mtDNA损伤的进行性积累。重要的是，线粒体基因的下调与多种不同癌症类型的侵袭和转移特征以及更差的临床结果相关。因此，有必要进一步检查改变mtDNA甲基化的功能后果，特别关注对细胞代谢的影响。

本研究报道了能够写入和擦除胞嘧啶甲基化的酶促机制在线粒体中存在且具有活性。5mC修饰通过两种不同DNMT酶的合作催化产生：DNMT1和DNMT3b。虽然不能排除其他5mC氧化机制的存在，但数据表明5hmC修饰是通过TET2的羟甲基化酶活性产生的。基因敲除线粒体DNMTs导致mtDNA甲基化谱改变，特别是在包含转录启动子HSP和LSP的关键调控区域。这种mtDNA 5mC水平的降低导致线粒体转录和mtDNA复制的急剧减少，这两者似乎是独立发生的。数据支持线粒体生理学的表观遗传调控作为维持细胞健康和稳态的一种机制的作用，并暗示异常的mtDNA甲基化与疾病相关。