基于CRISPR多重编辑和HLA-C匹配策略构建持久性通用型细胞治疗平台

《Cytotherapy》：A differentiated and durable allogeneic strategy applicable to cell therapies

本研究针对自体细胞疗法个体化制备成本高、周期长等瓶颈，开发了一种创新的通用型(Allo)策略。研究人员通过正交CRISPR/Cas9裂解酶/碱基编辑器及LNP/AAV递送系统，实现HLA-A/B/CIITA多重敲除并保留HLA-C，结合TRAC位点特异性整合CAR/TCR，成功构建了可规避宿主免疫排斥且具有持久抗肿瘤活性的通用型T细胞和iPSC衍生细胞。该平台为细胞治疗在肿瘤免疫和再生医学领域的广泛应用提供了新范式。

　　

在细胞治疗领域，自体CAR-T（嵌合抗原受体T细胞）疗法虽然已在血液肿瘤治疗中展现出显著疗效，但其广泛应用却面临诸多挑战。每位患者都需要个体化定制细胞产品，导致制备成本高昂、生产周期漫长，许多病情危重的患者往往等不到治疗时机。此外，经过多轮放化疗的患者，其T细胞质量可能较差，影响最终产品的疗效。更令人担忧的是，曾有报道称白血病患者的自体T细胞产品中混入肿瘤细胞，导致治疗耐药。这些因素共同制约了自体细胞疗法的普及。

为了突破这些限制，科学家将目光转向"现货型"通用型细胞疗法。但这条路同样布满荆棘：供体T细胞可能攻击宿主组织引发移植物抗宿主病(GvHD)；宿主免疫系统又会将外来细胞视为"异己"而进行清除。传统的解决方案如敲除B2M（β2微球蛋白）虽然能减少T细胞识别，却会激活自然杀伤(NK)细胞的"缺失自我"识别机制，导致细胞被快速清除。如何平衡这些相互矛盾的免疫反应，成为通用型细胞疗法发展的关键科学问题。

在这项发表于《Cytotherapy》的研究中，Intellia Therapeutics的Utsav Jetley、Ishina Balwani、Palak Sharma等研究人员提出了一种创新性的解决方案。他们开发了一种差异化的通用型平台，通过多重基因编辑策略同时解决GvHD和宿主免疫排斥两大难题。

研究团队采用的关键技术包括：基于生物信息学分析的sgRNA（单向导RNA）设计以实现HLA-A/B等位基因的广泛覆盖；利用正交CRISPR系统（Nme2Cas9碱基编辑器和SpyCas9裂解酶）通过LNP（脂质纳米粒）和AAV（腺相关病毒）递送进行多重基因编辑；通过流式细胞术、ddPCR（微滴式数字PCR）和dGH-FISH（定向基因组杂交）等技术全面评估编辑效率和基因毒性；建立人源化小鼠模型（如huNOG和NOG-IL15小鼠）进行体内功能验证；以及iPSC（诱导多能干细胞）定向分化为胰腺祖细胞和心肌细胞的技术。

Overview of the Allo platform

研究团队设计的通用型平台需要解决三个核心免疫学问题：GvHD、宿主T细胞介导的排斥和NK细胞介导的排斥。他们采用多重编辑策略：通过CRISPR/Cas9敲除TRAC基因座并插入治疗性CAR/TCR，防止GvHD；选择性敲除HLA-A和HLA-B但保留HLA-C表达，同时敲除CIITA以抑制HLA II类表达，减少宿主免疫识别。创新性地提出利用HLA-C纯合子供体，仅需匹配单个HLA-C等位基因即可实现"1/10全匹配"，生物信息学分析显示使用前7种HLA-C类型可覆盖约90%美国人群。

T Cell Engineering

研究人员比较了四种工程化方法：同时电转(EP_sim)、序贯电转(EP_seq)、序贯LNP转染(LNP_seq)和正交LNP编辑(LNP_ortho)。结果表明，LNP_ortho组细胞扩增倍数显著提高，编辑效率相当但基因毒性显著降低。ddPCR检测显示，LNP_ortho组的染色体易位频率接近背景水平，而传统核酸酶编辑方法易位频率较高。dGH-FISH分析进一步证实，碱基编辑策略大幅减少了染色体结构变异。功能上，LNP_ortho编辑的CAR-T细胞在连续再攻击实验中表现出强大的长期肿瘤杀伤能力，且衰竭标志物表达较低。

Addressing GvHD and HvG challenges related to Allo T cell therapies

在GvHD模型中，TCR敲除>98%的通用型T细胞在免疫缺陷小鼠中无增殖迹象，90天内未出现GvHD临床症状。在宿主T细胞排斥实验中，HLA-C匹配的宿主PBMC（外周血单核细胞）能杀死TCR敲除T细胞，但对通用型T细胞无杀伤作用。人源化小鼠体内实验进一步证实，通用型T细胞仅在HLA-C匹配宿主中持久存活。NK细胞杀伤实验中，通用型T细胞相比B2M敲除T细胞显著减少NK介导的溶解，HLA-C匹配提供额外保护作用。

Functionality of Allo-TCR-T cells and Allo-CAR-T cells

研究人员构建了靶向WT1（Wilms肿瘤基因1）的TCR-T细胞和靶向CD30的CAR-T细胞。体外杀伤实验显示，通用型编辑的T细胞与未进行通用型编辑的对应细胞具有相当的肿瘤细胞杀伤效力。在体内CD30+肿瘤模型中，通用型CD30 CAR-T细胞展现出与TCR敲除CD30 CAR-T细胞相当的肿瘤清除能力，证明多重编辑不影响细胞功能。

Application of the Allo platform in iPSCs

研究还将该平台扩展至iPSC领域。通过三重敲除(TKO)HLA-A、HLA-B和CIITA的iPSC细胞仍保持多能性标志物表达，并能成功分化为胰腺祖细胞和心肌细胞。混合淋巴细胞反应(MLR)实验表明，来自TKO iPSC的胰腺祖细胞受到HLA-C匹配宿主PBMC杀伤的程度显著降低，证明该策略在再生医学中同样具有应用潜力。

研究结论部分，作者系统讨论了通用型细胞疗法的发展现状和本研究的创新性。与传统方法相比，该平台通过HLA-C匹配策略避免了强效淋巴清除相关的感染风险，且不需要引入额外的免疫 evasion 分子（如HLA-E、CD47等）。临床数据回顾分析支持了HLA匹配对持久性的重要性，而本研究提出的"1/10全匹配"策略大幅简化了供体选择。基因编辑平台的优化——LNP递送、碱基编辑器和位点特异性整合——共同确保了产品的安全性和可扩展性。

这项研究的重大意义在于，它为解决通用型细胞疗法的持久性难题提供了全新思路，同时建立了一个可扩展至T细胞之外其他细胞类型的平台技术。通过精细的免疫学设计和先进的基因编辑工具，研究人员成功平衡了避免排斥和保留功能之间的复杂关系，为细胞治疗在更广泛疾病领域的应用开辟了新道路。该平台不仅适用于CAR-T/TCR-T细胞治疗，还有望推动iPSC衍生细胞产品在再生医学中的发展，真正实现"现货型"细胞治疗产品的临床转化。