HLA匹配与CRISPR编辑HLA I/II类分子实现异体人调节性T细胞疗法在人源化小鼠移植模型中的成功植入和有效功能

本刊推荐：为解决异体调节性T细胞(Treg)疗法因宿主免疫排斥而失效的难题，研究人员通过HLA精准匹配和CRISPR基因编辑技术（敲除B2M和CIITA基因并插入HLA-E-B2M融合基因），成功构建了低免疫原性Treg。该细胞能同时规避T细胞和NK细胞的攻击，在单次低剂量输注后，于人源化小鼠模型中显著延长人皮肤移植物存活时间，其效果与自体Treg相当，为“现货型”异体Treg疗法的临床转化提供了关键技术支撑。

　　

在自身免疫性疾病和移植排斥的治疗领域，调节性T细胞（Regulatory T cells, T_reg）因其强大的免疫抑制功能而备受瞩目。然而，目前临床研究主要采用自体T_reg疗法，即从患者体内分离T_reg，在体外扩增后回输。这种方法存在诸多局限：患者个体间T_reg数量和质量差异大，尤其对于年幼或年长患者，起始细胞数量可能不足；某些疾病本身可能导致T_reg功能受损；体外扩增过程耗时数周，无法满足紧急治疗需求（如器官移植后的急性排斥反应）；并且，个体化定制生产成本高昂，难以大规模推广应用。因此，开发来自健康供者的、预先制备好的“现货型”（off-the-shelf）异体T_reg产品，成为突破当前瓶颈的关键。但异体细胞不可避免地会遭遇宿主免疫系统的攻击，如何让这些“外来客”在宿主体内存活并发挥功能，是亟待解决的核心科学问题。

为了回答这一问题，由Oliver McCallion、Weijie Du、Viktor Glaser等人领导的研究团队在《Nature Communications》上发表了他们的最新研究成果。他们系统评估了异体T_reg面临的免疫排斥挑战，并创新性地结合人类白细胞抗原（Human Leukocyte Antigen, HLA）匹配策略和CRISPR基因编辑技术，成功构建了能够抵抗宿主T细胞和自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞攻击的低免疫原性异体T_reg，为通用型T_reg疗法的开发铺平了道路。

研究人员为开展此项研究，主要应用了以下几项关键技术：利用流式细胞术分选和体外扩增人原代T_reg；建立人皮肤异种移植-人源化小鼠模型以评估T_reg体内功能；运用非病毒CRISPR/Cas9系统进行基因编辑（包括敲除B2M和CIITA基因，以及通过同源定向修复插入HLA-E-B2M融合基因）；采用碱基编辑器（Adenine Base Editor, ABE）进行CIITA基因的精确沉默以消除HLA II类分子表达；通过体外抑制实验、细胞毒性实验（使用异体反应性T细胞系和原代NK细胞）评估T_reg功能和存活；并利用空间转录组学（Spatial Transcriptomics）和免疫组织化学分析移植物内的免疫微环境。研究中使用的细胞来源于健康供者的外周血单核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）以及获得伦理批准的人皮肤组织。

研究结果

异体T_reg在体外保持效力但在体内功效丧失

研究人员首先在体外比较了自体与异体T_reg抑制PBMCs增殖的能力。结果表明，无论是在抑制CD4⁺还是CD8⁺ T细胞增殖方面，异体T_{reg与自体Treg的效果相当，且对反应细胞活化标志CD25的表达影响也无显著差异。这说明Treg的免疫抑制功能在体外是HLA非依赖性的。然而，在人源化小鼠皮肤移植模型中，情况发生了逆转。虽然Treg治疗均能延长移植物存活时间，但异体Treg的保护效果显著低于自体Treg（中位生存期81.5天 vs >100天），这与体外实验结果形成了鲜明对比。}

体内CD8⁺ T细胞清除异体T_reg

为了探究异体T_reg体内功效降低的机制，研究人员进行了细胞存活实验。体外共培养实验中，异体T_reg的存活率与自体T_reg无差异。但在小鼠体内实验中，回收的异体T_reg数量显著低于自体T_reg。通过选择性剔除宿主PBMCs中的特定细胞亚群，他们发现剔除CD8⁺ T细胞能有效恢复异体T_reg的回收数量和增殖能力至自体T_reg水平，而剔除CD56⁺ NK细胞则无此效果。这表明异体T_reg在体内的快速清除主要由宿主的CD8⁺ T细胞介导。

严格的HLA I类和II类匹配恢复异体T_reg功效

既然CD8⁺ T细胞是清除异体T_reg的主要元凶，而CD8⁺ T细胞的活化依赖于HLA I类分子的抗原呈递，那么进行HLA匹配是否可行？研究人员筛选了超过150对T_reg/PBMC组合，评估了不同程度HLA匹配（完全错配、部分错配、部分匹配）的异体T_reg在低剂量输注下的效果。结果显示，接受完全错配和部分错配异体T_reg的小鼠迅速排斥了移植物，而接受部分匹配（HLA-A, -B, -C, -DR位点接近匹配）异体T_reg的小鼠则大多实现了移物的长期存活（>100天）。这证明严格的HLA匹配可以克服异体排斥，但在临床实践中为每位患者寻找高度匹配的供者极具挑战性。

CRISPR多重编辑HLA I类和II类分子创建低免疫原性T_reg

鉴于HLA匹配的临床局限性，研究人员转向基因编辑策略。他们利用CRISPR/Cas9技术，旨在消除T_reg表面的多态性HLA分子，使其不被宿主T细胞识别。首先，他们敲除了B2M基因以消除HLA I类分子表达（II, B2M KO）。然而，缺乏HLA I类分子的细胞会因“缺失自我”（missing-self）信号而被NK细胞攻击。为此，他们在敲除B2M的同时，通过同源定向修复将非多态性的HLA-E基因与B2M外显子2连接，构建了HLA-E-B2M融合基因（IV, HLA-E KI），使细胞表面表达抑制性配体HLA-E。为了进一步消除HLA II类分子，他们在已进行HLA-E敲入的T_reg上，使用腺嘌呤碱基编辑器（ABE8.20-m）靶向CIITA基因（V, HLA-E KI/CIITA KO, H/C T_reg），成功阻断了HLA II类分子的表达。经过多重编辑的T_reg（H/C T_reg）仍保持典型的T_reg表型（CD4⁺CD25⁺FOXP3⁺），FOXP3基因T_reg特异性去甲基化区域（Treg-specific demethylation region, TSDR）保持低甲基化状态，并且在体外抑制实验中表现出与自体T_reg相当的剂量依赖性抑制能力，且未产生过多的Th1型细胞因子。

HLA工程化T_reg规避NK细胞裂解

功能实验证实，表达HLA-E-B2M融合基因的T_reg（IV, HLA-E KI）相较于仅敲除B2M的T_reg（II, B2M KO），能更有效地抵抗活化NK细胞的杀伤，显示出HLA-E提供的NK细胞抑制性信号起到了部分保护作用。

HLA编辑的T_reg在体内促进移植物存活

在更具挑战性的体内模型中（完全HLA错配，低T_reg剂量），未编辑的异体T_reg无法保护皮肤移植物。而经过完全编辑的H/C T_reg在过继转移后21天仍能在外周血中检测到，并且其促进移植物存活的效果与自体T_reg相当。对移植物的分析显示，接受PBMC alone或PBMC加异体T_reg治疗的移植物呈现出强烈的排斥特征，包括急性炎症反应相关转录本的高表达。相反，接受自体或HLA工程化异体T_reg治疗的移植物则表现出免疫调节（如CD5L）、脂质呈递（如CD1A, CD1E）和组织稳态（如OGN, ARFGEF3）相关基因的富集，且细胞毒性T淋巴细胞（Cytotoxic T Lymphocytes）浸润显著减少，细胞异质性得以保持。

结论与讨论

本研究有力地证明了通过两种策略可以克服异体T_reg疗法面临的体内排斥障碍：一是近乎完全的HLA匹配，二是通过CRISPR多重基因编辑同时消除HLA I类和II类分子并引入NK细胞抑制性配体HLA-E。这两种策略均能显著延长异体T_reg在宿主体内的存活时间，使其能够建立有效的免疫调节环境，最终实现与自体T_reg相当的移植物保护效果。HLA匹配策略虽然有效，但供者寻找困难，限制了其作为“现货型”产品的广泛应用。因此，HLA基因编辑提供了一条更具可行性和可扩展性的临床转化路径。

研究还指出，HLA编辑的T_reg其免疫抑制功能可能通过T细胞受体（T Cell Receptor, TCR）依赖和非依赖途径共同发挥作用。未来的研究可考虑在低免疫原性的基础上，进一步引入靶向特定抗原的嵌合抗原受体（Chimeric Antigen Receptor, CAR），以增强其靶向性和效力。同时，研究人员也谨慎地提到，完全消除HLA分子可能带来的潜在风险，如对细胞内病原体或恶性转化的免疫监视减弱，因此在临床推进中考虑加入安全开关（safety switch）是必要的。

总之，这项研究标志着向“现货型”异体T_reg细胞疗法临床转化迈出了关键一步。它不仅为移植耐受诱导提供了新策略，其揭示的机制——即通过基因编辑赋予细胞低免疫原性以抵抗宿主免疫攻击——也具有更广泛的适用性，有望应用于其他免疫介导的疾病治疗中。未来的工作将聚焦于优化编辑策略以提高效率和安全性，并探索其在更多疾病背景下的治疗潜力。