PFKL非经典功能：PFKL作为内源性HDAC抑制剂通过调控锌稳态增强组蛋白去乙酰化酶抑制剂在实体瘤中的疗效

本研究针对组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)在实体瘤中疗效不佳的临床难题，发现肝型磷酸果糖激酶(PFKL)具有非经典功能——作为内源性HDAC抑制剂。研究人员通过全基因组CRISPR-Cas9筛选发现PFKL缺失导致HDACi耐药，机制研究表明核定位PFKL直接结合I类HDACs的锌结合位点，降低其锌含量并抑制酶活性。特别值得注意的是，PFKL的Thr562残基增强罗米地辛的锌结合基团(ZBG)与HDACs锌离子的螯合效应。基于此机制研发的治疗性多肽PFKL-552-572-R8，在体外和体内实验中均显著增强罗米地辛的抗肿瘤效果，为克服实体瘤HDACi耐药提供了新策略。

　　

在肿瘤治疗领域，表观遗传药物尤其是组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDACi)的发展令人瞩目。这类药物通过抑制组蛋白去乙酰化酶(HDACs)活性，增加组蛋白乙酰化水平，从而激活抑癌基因表达，诱导肿瘤细胞凋亡。然而，尽管HDACi在血液系统恶性肿瘤中展现出显著疗效，其在实体瘤中的临床效果却始终不尽如人意。胆管癌(CCA)作为起源于胆道系统的恶性肿瘤，患者预后极差，常规化疗方案客观缓解率低，且易产生耐药性。这种疗效差异背后的分子机制一直未被完全阐明，严重限制了HDACi在实体瘤中的临床应用。

针对这一难题，Taiyu Shang、Tianyi Jiang等研究人员在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上发表了一项突破性研究。他们发现肝型磷酸果糖激酶(PFKL)——这一糖酵解通路中的关键限速酶，竟然具有全新的非经典功能：作为内源性HDAC抑制剂，直接参与调控表观遗传状态和HDACi的药物疗效。

为了揭示HDACi在胆管癌中的作用机制，研究团队首先进行了高通量药物筛选，发现HDAC抑制剂在胆管癌细胞中表现出显著的细胞毒性作用，其中罗米地辛(romidepsin)和帕比司他(panobinostat)效果最为突出。然而，不同胆管癌细胞系对HDACi的敏感性存在明显差异，这提示可能存在某种内在的调控机制。

通过全基因组CRISPR-Cas9筛选，研究人员意外地发现PFKL的缺失会特异性导致癌细胞对HDAC抑制剂产生耐药性。这一发现令人惊讶，因为PFKL长期以来被认为主要参与糖酵解代谢，与表观遗传调控似乎没有直接关联。进一步实验证实，PFKL表达水平与HDACi敏感性呈正相关：高表达PFKL的胆管癌细胞对HDACi敏感，而低表达细胞则表现出耐药性。

尤为关键的是，研究人员发现PFKL对HDACi疗效的调控独立于其代谢功能。即使使用糖酵解抑制剂或突变PFKL的酶活性位点，也不会影响细胞对罗米地辛的敏感性。这一发现将PFKL的代谢功能与其对HDACi的调控作用分离开来，暗示PFKL可能通过全新的机制参与表观遗传调控。

深入机制探索揭示了令人振奋的发现：PFKL能够定位到细胞核内，直接与I类HDACs（包括HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8）相互作用。通过免疫共沉淀、GST pull-down和表面等离子共振等技术，研究人员证实PFKL通过其C端调控区域与HDACs的170-183氨基酸区域（包含锌结合残基D176和H178）直接结合。这种相互作用导致HDACs的锌含量降低，进而抑制其去乙酰化酶活性。

分子动力学模拟揭示了更为精细的机制：PFKL的Thr562残基能够增强罗米地辛的锌结合基团与HDACs中锌离子的螯合效应，形成更稳定的三元复合物，从而提高药物效能。当PFKL缺失时，罗米地辛与锌离子的螯合距离增加，药物抑制作用减弱。

基于这一机制，研究团队设计了一种细胞穿透性治疗肽PFKL-552-572-R8。实验证明，该肽段能显著增强罗米地辛在胆管癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等多种实体瘤中的抗肿瘤效果，特别是在原本对HDACi耐药的肿瘤模型中展现了良好的增敏作用。

研究中使用的主要技术方法包括：全基因组CRISPR-Cas9筛选鉴定PFKL为关键调控因子；患者来源异种移植(PDX)模型评估体内药效；分子动力学模拟分析蛋白质-药物相互作用；表面等离子共振(SPR)检测结合亲和力；CUT&Tag技术分析组蛋白修饰图谱。

PFKL状态决定HDAC抑制剂在胆管癌中的疗效

通过高通量药物筛选发现，HDAC抑制剂在胆管癌细胞中表现出显著细胞毒性，其中罗米地辛和帕比司他效果最优。全基因组CRISPR-Cas9筛选揭示PFKL缺失特异性导致HDACi耐药。临床前模型证实PFKL表达水平与HDACi敏感性正相关，PFKL高表达的患者来源异种移植(PDX)模型对HDACi治疗反应良好。

PFKL增强罗米地辛疗效不依赖其代谢功能

尽管PFKL缺失显著降低糖酵解速率，但糖酵解抑制剂或PFKL酶活性调节剂并不影响细胞对罗米地辛的敏感性。酶活性缺失的PFKL突变体仍能恢复PFKL缺失细胞对HDAC抑制剂的敏感性，证实PFKL对HDACi疗效的调控独立于其代谢功能。

PFKL直接与I类HDACs相互作用调控表观遗传状态

免疫荧光和细胞分级实验证实PFKL存在核定位。PFKL主要与I类HDACs结合，这种相互作用通过其C端区域与HDACs的锌结合位点实现。PFKL结合降低HDACs的锌含量，抑制其酶活性，从而增加组蛋白H3K9和H3K27位点的乙酰化水平。

PFKL促进罗米地辛与HDAC1内锌的螯合效应

分子动力学模拟显示，PFKL的Thr562残基与罗米地辛形成额外相互作用，增强其锌结合基团与HDACs锌离子的螯合效果。三元复合物结合自由能低于二元复合物，表明PFKL存在时罗米地辛结合更稳定。Thr562缺失或突变显著减弱PFKL与HDAC1的结合及药物增敏效果。

PFKL衍生多肽552-572-R8增强罗米地辛疗效并扩展其在实体瘤中的应用

基于作用机制设计的治疗肽PFKL-552-572-R8包含C端八个精氨酸残基(R8)以促进细胞摄取和核靶向。该肽段能显著增强罗米地辛在胆管癌、乳腺癌、肺癌和卵巢癌等多种实体瘤中的抗肿瘤效果，特别是在原本耐药的肿瘤模型中展现良好的增敏作用。

这项研究的重要意义在于首次揭示了PFKL作为内源性HDAC抑制剂的全新非经典功能，突破了传统上对代谢酶功能的认知边界。研究发现不仅阐明了HDACi在实体瘤中疗效差异的分子基础，更重要的是提出了通过靶向PFKL-HDAC相互作用来增强HDACi疗效的创新策略。研发的治疗性多肽PFKL-552-572-R8为克服实体瘤HDACi耐药提供了切实可行的解决方案，具有重要的临床转化价值。

从更广泛的视角来看，这项研究揭示了代谢与表观遗传调控之间的深刻联系，为理解肿瘤细胞中代谢重编程与表观遗传异常之间的相互调控提供了新范式。PFKL作为糖酵解关键酶与表观遗传调控因子的双重身份，提示肿瘤代谢异常可能直接参与表观遗传状态的塑造，这一发现将为未来肿瘤治疗策略的设计提供新的思路。

研究还提出了"锌稳态"调控的新概念，PFKL通过调节HDACs的锌含量影响其酶活性，这为理解锌离子在表观遗传调控中的作用提供了新视角。相对于直接抑制HDAC酶活性，靶向HDAC复合物或其相关蛋白可能实现更精确的表观遗传调控，减少副作用，这为HDAC抑制剂的未来发展指明了新方向。

综上所述，这项研究不仅解决了HDACi在实体瘤中疗效不佳的具体临床问题，更重要的是开辟了代谢酶参与表观遗传调控的新研究领域，为肿瘤的联合治疗提供了新的靶点和策略，具有重要的理论意义和临床价值。