米曲霉Aokap9基因敲除通过AoZFA-LaeA-KojR通路调控曲酸合成的机制研究

《Microbial Cell Factories》：Aokap9 gene knockout contributes to kojic acid synthesis in Aspergillus oryzae

本研究针对米曲霉中曲酸合成调控机制不清的问题，通过CRISPR/Cas9技术敲除Aokap9基因，发现其缺失可显著提升曲酸产量。研究揭示了AoKap9通过AoZFA-LaeA-KojR通路负调控曲酸合成的新机制，并证实该基因参与氧化应激反应。该成果为米曲霉代谢工程改造提供了重要靶点，对曲酸工业化生产具有重要指导意义。

　　

在工业生物技术领域，米曲霉（Aspergillus oryzae）作为一种安全的丝状真菌，被广泛应用于食品、酶制剂和医药原料的生产。其中，曲酸（kojic acid）作为其重要的次级代谢产物，在化妆品、食品和医药领域具有重要价值。然而，曲酸合成调控网络复杂，许多关键调控基因的功能尚未明确，限制了高产菌株的理性设计。

以往研究发现，曲酸合成基因簇包含kojA、kojR和kojT三个关键基因，其中KojR作为锌指转录因子激活kojA和kojT的表达。全局调控因子LaeA和锌指蛋白AoZFA也被证实参与曲酸合成的调控。然而，这些已知基因仍不能完全解释曲酸合成的精细调控机制，特别是膜蛋白在其中的作用尚不明确。

针对这一科学问题，邱婷等人发表在《Microbial Cell Factories》的研究，通过对米曲霉基因敲除突变体库的筛选，发现了一个新型基因Aokap9，该基因编码一个含有两个跨膜结构域的未知功能蛋白。研究人员采用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建Aokap9敲除株，通过表型分析、基因表达检测、转录组测序等技术手段，系统阐明了AoKap9在曲酸合成中的调控功能及其分子机制。

研究主要采用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9系统进行基因敲除和过表达株构建；通过定量PCR（qRT-PCR）分析基因表达水平；采用转录组测序（RNA-seq）进行差异表达基因分析；使用比色法测定曲酸产量；通过点接种实验评估菌株生长和产孢特性。

Aokap9的鉴定与特征分析

生物信息学分析显示，AoKap9蛋白在其N端和C端各含有一个跨膜结构域。系统进化分析表明，AoKap9与黄曲霉（Aspergillus flavus）中的同源蛋白亲缘关系最近，与其他曲霉属物种的同源蛋白相似性较低。这种独特的序列特征提示AoKap9可能在米曲霉中具有特异性的功能。

Aokap9参与生长和产孢调控

通过CRISPR/Cas9技术成功获得两个Aokap9敲除突变体（ΔAokap9-1和ΔAokap9-2）。表型分析发现，敲除株在CD固体培养基上生长显著减慢，产孢量也明显减少，说明Aokap9参与米曲霉菌丝生长和无性繁殖的调控。

Aokap9敲除促进曲酸合成

在曲酸发酵培养基中培养7天后，ΔAokap9突变体的曲酸产量达到野生型的2倍。基因表达分析显示，曲酸合成关键基因kojA、kojR和kojT的mRNA水平在突变体中显著上调，这与产量提高的结果一致。

Aokap9通过laeA和kojR调控曲酸合成

为了阐明调控机制，研究人员构建了ΔAokap9ΔkojR双敲除株。结果显示，kojR的缺失完全消除了ΔAokap9突变体曲酸产量的增加，表明KojR位于AoKap9下游发挥作用。同时，laeA在ΔAokap9突变体中的表达水平显著升高，而ΔAokap9ΔlaeA双敲除株完全丧失曲酸合成能力，证实LaeA也参与AoKap9的调控通路。

AozfA过表达抑制ΔAokap9的曲酸产量

先前研究表明锌指蛋白AoZFA通过影响kojR表达负调控曲酸合成。本研究发现ΔAokap9突变体中AozfA表达下降，而在ΔAokap9背景中过表达AozfA可部分抑制曲酸产量的增加，说明AoKap9可能通过影响AoZFA参与曲酸合成调控。

AoKap9参与氧化应激反应

转录组分析发现，ΔAokap9突变体中有320个基因上调，362个基因下调。GO富集分析显示差异基因显著富集在过氧化氢代谢过程、过氧化氢酶活性等氧化应激相关通路。超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）等抗氧化酶基因表达上调，而铜胺氧化酶（CoAO）表达下调。表型实验证实ΔAokap9突变体对H₂O₂和甲萘醌亚硫酸氢钠（MSB）更敏感，进一步支持AoKap9参与氧化应激调控。

Aokap9在高产曲酸菌株构建中的应用潜力

研究人员尝试将Aokap9敲除与其他遗传改造相结合，以进一步提高曲酸产量。ΔAokap9-OE-kojR菌株的曲酸产量比单基因改造菌株提高1.3倍，而ΔAokap9ΔAozfA双敲除株的产量比单敲除株提高1.5倍。然而，ΔAokap9ΔAozfA-OE-kojR三基因改造株未能实现产量的进一步增加，提示同一调控通路中的多个基因同时改造可能不是有效的策略。

本研究首次揭示了AoKap9通过AoZFA-LaeA-KojR通路调控曲酸合成的分子机制，并发现该基因参与氧化应激响应。研究不仅阐明了米曲霉中一条新的曲酸合成调控通路，还为理性设计高产曲酸菌株提供了重要靶点。特别值得注意的是，AoKap9作为膜蛋白的鉴定扩展了对曲酸合成调控网络的认识，其独特的蛋白结构特征也为研究真菌次级代谢调控提供了新视角。

该研究的创新性在于发现了一个新型调控基因，并系统阐明了其在曲酸合成中的核心地位。研究结果对理解真菌次级代谢调控网络具有重要理论意义，同时为工业微生物育种提供了实践指导。未来基于Aokap9的代谢工程策略有望显著提高曲酸生产效率，推动相关产业的发展。