经过工程设计的、具有热稳定性和化学响应性的发光Cas9系统，用于实时治疗监测应用

《ANGEWANDTE CHEMIE-INTERNATIONAL EDITION》：Engineered Thermostable Chemically Responsive GlowCas9 System for Real-Time Therapeutic Monitoring Applications

CRISPR-Cas9系统GlowCas9实现实时追踪与高效基因编辑，提升热稳定性并增强HDR修复能力，适用于细胞、凝胶及活体等多种实验系统。

　　

摘要

规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）/CRISPR相关蛋白（Cas）由于其设计的便捷性和高效性，彻底改变了基因治疗的应用，尽管也存在脱靶效应。具有时空调控功能的Cas9由于较低的脱靶基因毒性，提供了更安全的基因编辑方法；然而，实时监测Cas9以评估其递送效率、基因编辑时间框架和空间靶标信息仍然具有挑战性。在这里，我们报告了一种经过工程改造的Cas9系统——GlowCas9，它可以在所有检测系统中进行实时化学检测，包括细胞裂解物、天然凝胶、体外和体内环境。重要的是，我们对Cas9系统进行了合理设计，使其具有优异的热稳定性并提升了基因编辑活性。除了具有敏感的报告基因和增强的基因编辑活性外，GlowCas9系统在细胞中还表现出基于精确HDR的基因敲入能力，并显著优于WTCas9。总体而言，我们开发了一种新的热稳定工程化SpCas9系统，适用于多种检测格式，包括活体体外和体内实验，可用于实时治疗追踪。这种GlowCas9系统将为基因治疗的发展（无论是体外还是体内）带来非侵入性的实时追踪新维度。

图形摘要

通过将分裂的纳米荧光酶融合到CRISPR相关蛋白SpCas9中，我们成功构建了一种热稳定且具有报告功能的酶GlowCas9。GlowCas9在体外和体内均具有高度敏感性，且无需昂贵的抗体即可检测。这种双功能酶在基因编辑和基于同源性的DNA修复应用中优于野生型Cas9。该蛋白质工程策略可推广到其他CRISPR酶的类似物，如SaCas9。

利益冲突

作者声明不存在利益冲突。