基于CRISPR-Cas9核糖核蛋白编辑的植物乳杆菌和短乳杆菌溶血素基因敲除及其安全性提升研究

本研究针对乳酸菌基因编辑工具匮乏及潜在溶血活性安全隐患，开发了一种基于Cas9-gRNA核糖核蛋白（RNP）复合物的新型基因组编辑平台。研究人员成功在植物乳杆菌（L. plantarum）和短乳杆菌（L. brevis）中实现hlyIII基因的50bp缺失及终止密码子插入，突变株溶血活性显著降低（最高达74.3%），为益生菌工程化提供了高效、无质粒残留的精准编辑策略。

　　

在益生菌研究领域，乳酸菌（Lactic Acid Bacteria, LAB）因其卓越的发酵能力和益生特性备受关注。然而，与大肠杆菌（Escherichia coli）和酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）等模式生物相比，乳酸菌的基因编辑技术发展相对滞后。传统的质粒依赖型CRISPR-Cas系统存在编辑效率低、菌株特异性强、易产生编辑逃逸及外源基因整合等问题，严重限制了益生菌工程化的应用潜力。更值得警惕的是，包括植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）和短乳杆菌（Levilactobacillus brevis）在内的常见益生菌，在免疫功能低下个体中可能引发菌血症和败血症，其潜在的安全隐患——如溶血素（hemolysin）相关基因的存在——为益生菌的临床应用蒙上了一层阴影。尽管基因组注释显示多种乳酸菌含有hlyIII等溶血素相关基因，但其功能性溶血活性至今尚未明确证实。为解决这些技术瓶颈与安全性疑虑，研究人员在《World Journal of Microbiology and Biotechnology》上发表了一项创新研究，通过核糖核蛋白（Ribonucleoprotein, RNP）介导的CRISPR-Cas9基因编辑技术，成功敲除了植物乳杆菌和短乳杆菌中的hlyIII基因，为开发更安全的工程化益生菌提供了新思路。

本研究主要采用了几项关键技术方法：首先，通过电转化法将表达RecE/T重组酶的质粒pLH01/pLH02导入目标菌株，以增强同源重组效率；其次，利用预组装的Cas9-gRNA RNP复合物（包含靶向hlyIII基因的sgRNA和Cas9核酸酶）与双链供体DNA共同电转，实现基因编辑；第三，通过菌落PCR和测序分析验证hlyIII基因的50bp缺失及终止密码子插入；最后，采用5%绵羊血琼脂平板定性分析和人红细胞定量溶血实验（通过Harboe法测定游离血红蛋白浓度）评估基因敲除后的溶血活性变化。研究所用植物乳杆菌SPC 72-1和短乳杆菌SPC-SNU 70-2由SPC食品与生物技术研究所提供。

Establishment of RNP-mediated CRISPR-Cas9 editing in L. plantarum WCFS1

通过优化高盐培养基中的电转化条件并引入RecE/T重组酶系统，研究人员在植物乳杆菌WCFS1中实现了hlyIII基因的精准编辑。测序结果显示突变体成功引入50bp缺失及终止密码子（TAA），菌落PCR分析显示编辑效率达96.4%。

Establishment of RNP meditated CRISPR-Cas9 editing in L. plantarum SPC 72-1

基于hlyIII基因序列高度保守性，使用相同sgRNA与修复模板在植物乳杆菌SPC 72-1中完成编辑，突变体获得85%的编辑效率。测序验证了基因结构的精准改变，但首次培养中均呈现野生型与突变体的混合条带，需通过亚培养获得纯合突变体。

Establishment of RNP-mediated CRISPR-Cas9 editing in L. brevis SPC-SNU 70-2

针对短乳杆菌细胞壁结构特点，采用甘氨酸、溶菌酶等处理提升RNP复合物递送效率。突变体出现野生型（209bp）、突变型（162bp）和未知上条带的三带现象，测序证实目标序列成功编辑。

Comparison of hemolysis of hlylII inactivated mutant with wild type

溶血表型分析显示，野生型植物乳杆菌在血琼脂平板上呈现α-溶血（绿晕现象），而突变体溶血圈显著缩小。定量检测发现，植物乳杆菌WCFS1、SPC 72-1和短乳杆菌SPC-SNU 70-2突变体的游离血红蛋白水平分别降低27.0%、74.3%和5.0%，表明hlyIII基因敲除对溶血活性具有菌株依赖性抑制作用。

本研究成功构建了一种不依赖质粒的RNP-CRISPR编辑平台，显著提升了乳酸菌基因编辑的效率与安全性。尽管在编辑过程中观察到混合基因型菌落现象，且hlyIII基因与溶血活性的功能性关联仍需进一步验证，但该技术为益生菌的精准工程化提供了重要工具。通过消除外源基因残留风险并实现快速基因组修饰，这项研究为开发靶向递送疫苗、抗癌制剂等新型益生菌疗法奠定了方法学基础，有望推动益生菌在代谢性疾病、感染性疾病及癌症治疗等领域的应用突破。