基于单发夹酶级联四重富集系统耦合CRISPR/Cas12a的超灵敏汉坦病毒检测新方法

本研究创新性地构建了基于单发夹探针的酶级联四重富集（SH-ECE）系统，结合CRISPR/Cas12a技术，实现了对新型汉坦病毒（DBSV）的超灵敏检测。该系统仅需一个发夹探针（HP）即可在靶基因存在时触发四级循环放大反应，通过链置换扩增（SDA）技术产生大量模拟靶DNA和功能链。CRISPR/Cas12a的引入进一步放大信号并增强特异性，可区分单/双/三碱基突变的RNA，检测限达16.7 fM（S/N=3）。该方法在人和啮齿类动物血清样本中验证成功，为CRISPR与SH-ECE系统联用的分子诊断提供了新范式。

　　

Highlight

本研究的亮点在于通过巧妙的发夹探针设计，实现了无需外源引物的四级信号放大。独特的回文序列结构使HP具备自引导功能，在聚合酶和切口酶（Nt.BbvCI）作用下触发双重链置换扩增（SDA）级联反应，显著提升检测灵敏度。CRISPR/Cas12a系统的引入犹如给检测装上了"分子雷达"，其反式切割活性可非特异性切割信号探针，实现荧光信号的指数级放大。

Materials and reagents

所有寡核苷酸由上海生工生物工程股份有限公司合成（序列见表S1）。实验中使用的EnGen? Lba Cas12a（Cpf1）酶、10× NEBuffer r2.1（含1000 μg/mL BSA、500 mM NaCl等）、Nt.BbvCI切口酶及10× CutSmart Buffer购自北京NEB公司。脱氧核糖核苷酸（dNTP）混合液、Klenow Fragment（KF）聚合酶及其缓冲体系（含1 mM DTT、70 mM Tris-HCl等）均采用分子生物学级别试剂。

Principle for DBSV-S-MT1 Detection

如Scheme 1所示，SH-ECE系统的发夹探针HP包含五大功能域（Scheme 1A）：

（1）靶标/触发链识别域：特异性结合汉坦病毒靶基因（DBSV-S-MT1）或触发链；

（2）燃料链结合域：携带燃料链互补序列；

（3）回文自杂交域：含反向重复序列，使HP可自发形成茎环结构；

（4）酶切位点域：为Nt.BbvCI提供特异性切割位点；

（5）信号输出域：参与CRISPR/Cas12a系统的信号转换。

当靶基因存在时，HP的茎环结构被打开，暴露出酶切位点。在KF聚合酶和Nt.BbvCI协同作用下，第一轮SDA反应产生触发链和燃料链。触发链可像"分子接力棒"一样激活新一轮扩增，而燃料链则作为CRISPR/Cas12a的激活剂，开启荧光信号产生的"分子开关"。

Conclusion

我们成功构建了SH-ECE与CRISPR/Cas12a联用的传感平台，其创新性体现在：回文序列设计使HP具备自引物功能，无需外源引物即可完成四级放大；双重SDA反应与CRISPR系统形成信号放大"双引擎"，检测灵敏度提升至fM级别；该策略对碱基突变具有高分辨率，在汉坦病毒早期诊断和变异监测中展现巨大应用潜力。