基于银和离子液体共功能化MXene的比率型分子印迹电化学传感器用于棒曲霉素的高灵敏高选择性检测

本文开发了一种结合单发夹酶级联四重富集(SH-ECE)系统与CRISPR/Cas12a的传感平台，用于大别山正汉坦病毒(DBSV)检测。该设计通过单发夹探针实现四重循环放大，结合CRISPR/Cas12a的反式切割活性，使检测限达16.7 fM，可区分单/双/三碱基突变，在血清样本中验证了实用性，为汉坦病毒早期诊断提供了新策略。

　　

Highlight

该研究的创新亮点在于：首次将单发夹探针(HP)与酶级联四重富集(SH-ECE)系统耦合CRISPR/Cas12a技术，实现了对大别山正汉坦病毒(DBSV)的超灵敏检测。该系统通过巧妙的回文序列设计，仅需一个发夹探针即可启动四级循环反应，无需外源引物，显著简化操作流程。CRISPR/Cas12a的引入不仅增强了特异性，还能精准区分碱基突变，在临床血清样本中展现出卓越的应用潜力。

Materials and reagents

所有寡核苷酸由生工生物工程（上海）股份有限公司合成（序列见表S1）。EnGen? Lba Cas12a (Cpf1)、10× NEBuffer r2.1（含1000 μg/mL BSA、500 mM NaCl、100 mM Tris-HCl、100 mM MgCl₂，pH 7.9）、Nt.BbvCI核酸内切酶及10× CutSmart Buffer（含1 g/mL BSA、500 mM KAc、200 mM Tris-HAc、100 mM MgAc₂，pH 7.9）购自北京NEB公司。脱氧核糖核苷酸(dNTP)混合物、Klenow Fragment (KF)聚合酶、10× KF Buffer（含1 mM DTT、70 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂，pH 7.9）等试剂均采用分子生物学级别。

Principle for DBSV-S-MT1 Detection

SH-ECE系统的工作原理如Scheme 1所示。发夹探针(HP)包含五个功能区域（Scheme 1A）：（1）靶标/触发链识别域，特异性结合DBSV-S-MT1或触发链；（2）燃料链结合域，含燃料链互补序列；（3）发夹回文杂交域，通过回文结构实现自发折叠；（4）核酸内切酶识别位点（Nt.BbvCI切割位点）；（5）聚合酶延伸区域。当靶标存在时，HP与DBSV-S-MT1结合引发构象变化，暴露酶切位点，在聚合酶(KF)和切口酶(Nt.BbvCI)作用下启动第一轮链置换扩增(SDA)，释放触发链和燃料链。触发链可再次激活HP引发第二轮SDA，形成四重级联放大。产生的燃料链激活Cas12a-crRNA复合物，触发反式切割反应，水解荧光信号探针，实现信号输出。

Conclusion

大别山正汉坦病毒(DBSV)对人类健康构成潜在威胁，本研究成功构建了SH-ECE与CRISPR/Cas12a联用的传感平台，实现了DBSV-S-MT1的快速、高灵敏检测。该策略通过回文序列设计使HP自带引物功能，无需外源引物，简化实验流程。此外，该方法具备单碱基分辨率，在血清样本中表现优异，为CRISPR/Cas与酶级联放大系统的联合应用提供了新范式。