利用Cas9核糖核蛋白电穿孔技术高效编辑延长保存牛卵巢来源体外受精合子的基因组

本研究针对牛胚胎基因组编辑中传统体外受精流程导致的CRISPR-Cas9电穿孔操作时间不便（常需午夜进行）以及嵌合体现象严重的问题，探索了利用延长保存（14–18°C, 20–22小时）屠宰场牛卵巢来源合子进行Cas9 RNP电穿孔编辑的可行性。研究发现，延长保存卵巢不影响卵母细胞发育能力；电穿孔在30V场强和6μM Cas9-RNP浓度下能实现最高编辑效率（81.5%），但高电压（35V）会降低胚胎发育率，且嵌合体问题仍普遍存在。该研究为CRISPR牛胚胎编辑提供了更灵活、高效的实验方案，显著提升基因组编辑技术在农业和生物医学研究中的可及性。

　　

牛胚胎作为研究人类植入前发育的重要模型，在基因组编辑研究中的应用日益广泛。CRISPR-Cas9技术通过对特定基因位点进行精准编辑，为培育优良性状畜牧品种和治疗遗传性疾病提供了革命性工具。然而，该技术在牛胚胎应用时面临两大挑战：一是传统体外受精（IVF）流程中，合子最佳电穿孔编辑时间通常在午夜，操作极其不便；二是编辑后的胚胎普遍存在嵌合体现象（即同一胚胎中同时存在编辑和未编辑细胞），严重降低编辑效率和后代基因一致性。此外，许多研究机构无法就近获取新鲜牛卵巢，限制了基因组编辑技术的普及。

为解决这些问题，来自德国哥廷根大学的研究团队在《Theriogenology》上发表论文，系统探讨了利用延长保存的屠宰场牛卵巢（磷酸盐缓冲液，14–18°C储存20–22小时）来源的合子进行Cas9 RNP电穿孔基因组编辑的可行性。他们重点优化了电穿孔场强和Cas9-RNP浓度，以期在提高编辑效率的同时减少嵌合体产生，并建立更人性化的实验时间安排。

研究主要采用了以下关键技术方法：从延长保存的牛卵巢中采集卵母细胞，经体外成熟和受精获得合子；使用针对牛酪氨酸酶基因（TYR）的CRISPR-Cas9 RNP复合物（因该基因敲除可产生可见白化表型且非致死）；在受精后10小时对合子进行电穿孔（不同电压和RNP浓度）；通过体外培养至囊胚阶段评估发育率；采用PCR扩增、Sanger测序和ICE（Inference of CRISPR Edits）分析编辑效率和类型；统计方法采用ANOVA和卡方检验。

3.1. 新鲜与延长保存卵巢来源卵母细胞的体外发育指标

结果显示，延长保存卵巢获得的卵母细胞，其卵裂率和囊胚形成率（D7: 18.4±4.5%; D8: 24.6±4.9%）与新鲜卵巢组（D7: 21.0±4.7%; D8: 27.3±7.5%）无显著差异，表明延长保存不影响卵母细胞的发育能力。

3.2. 电穿孔电压对囊胚编辑率的影响

比较15V、20V和25V电压下的编辑效果发现，25V组囊胚编辑率最高（40.7%），显著高于20V（9.5%）和15V（0%）。但25V和20V均显著降低合子存活率和卵裂率。编辑率按发育阶段标准化后，25V组在囊胚/卵裂胚/存活合子/总电穿孔合子中的比例均最高。

3.3. 电穿孔电压对囊胚编辑事件的影响

进一步比较25V、30V和35V电压，发现30V和35V的囊胚编辑率（66.7%和67.9%）显著高于25V（31.8%），但35V组的卵裂率和囊胚率最低。25V组单等位基因编辑比例较高（48.1%），而30V和35V组双等位基因和嵌合编辑比例更高。35V组完全编辑囊胚中嵌合体比例数值上最高（41.1%），但无统计差异。

3.4. Cas9-RNP浓度对发育指标和囊胚编辑率的影响

使用30V电压比较3μM和6μM Cas9-RNP浓度，发现6μM组囊胚编辑率（81.5%）显著高于3μM组（60.0%），但两组在卵裂率、囊胚率及编辑类型（单/双等位基因、嵌合体）分布上无显著差异。高浓度（6μM）RNP虽提高编辑效率，但胚胎发育率有所下降。

研究结论表明，利用延长保存牛卵巢来源的合子进行Cas9 RNP电穿孔编辑是可行且高效的。电穿孔最佳条件为30V场强和6μM Cas9-RNP浓度，此时能在保持可接受发育率的同时获得最高编辑效率。然而，嵌合体现象仍然普遍，提示未来需进一步优化编辑时序与细胞周期同步性，以提高编辑一致性和纯度。该研究不仅为牛基因组编辑提供了更灵活的实验方案（避免午夜操作），还使偏远地区也能利用转运卵巢开展相关研究，显著提升了CRISPR技术在畜牧业和生物医学研究中的适用性和可及性。