第三组固有淋巴细胞来源的CSF2调控组织巨噬细胞与中性粒细胞稳态的新机制

本研究针对固有淋巴细胞3组(ILC3)研究工具匮乏的瓶颈问题，开发了基于CRISPR/Cas9基因编辑的MNK3细胞研究体系。研究人员通过体内外实验证实，ILC3来源的集落刺激因子2(CSF2)不仅调控肠道CCR2+巨噬细胞发育，还在肝脏和脾脏髓系细胞稳态维持中发挥关键作用，为天然免疫细胞功能研究提供了重要技术平台。

　　

在人体与微生物共生的黏膜表面，一群特殊的免疫哨兵——第三组固有淋巴细胞（ILC3）正发挥着至关重要的作用。这些组织驻留淋巴细胞通过产生白细胞介素22（IL-22）和集落刺激因子2（CSF2）等关键细胞因子，不仅守护着肠道屏障的完整性，还精细调控着局部免疫微环境的平衡。然而，由于ILC3研究的特殊性，科学界一直面临着一个严峻挑战：缺乏易于操作、成本效益高的研究工具。传统转基因动物模型构建周期长、成本高昂，而原代ILC3细胞的分离培养又极具技术难度，且需要大量实验动物，这些限制因素使得许多实验室对ILC3研究望而却步。

正是在这样的研究背景下，多伦多大学免疫学系的科研团队在《Mucosal Immunology》上发表了一项突破性研究。他们开发了一套经济高效的实验方案，利用先前报道的ILC3样细胞系MNK3，结合CRISPR/Cas9基因编辑技术，建立了一个可广泛应用的ILC3研究平台。这项研究不仅解决了技术瓶颈问题，更揭示了ILC3来源的CSF2在多个器官髓系细胞稳态调控中的全新功能。

研究人员采用的核心技术方法包括：利用CRISPR/Cas9系统对MNK3细胞进行基因敲除（针对Thy1、Il22和Csf2基因），通过流式细胞术分析细胞表型和细胞因子产生，建立Rag2^-/-Il2rg^-/-免疫缺陷小鼠的细胞过继转移模型，使用肠炎模型（Citrobacter rodentium感染）和非甾体抗炎药（吲哚美辛）诱导的肠道炎症模型进行评估，并通过组织学分析、免疫荧光和酶联免疫吸附测定（ELISA）等多种手段验证表型。

MNK3成功定植小肠和肝脏

研究团队首先验证了MNK3细胞在免疫缺陷小鼠体内的定植能力。通过静脉注射5×10⁶个MNK3细胞到Rag2^-/-Il2rg^-/-小鼠体内，他们发现这些细胞不仅能够成功定植于小肠，还在肝脏、脾脏、骨髓和胸腺等多个器官中被检测到。重要的是，移植后的MNK3细胞保持了典型的ILC3表型特征，持续表达RORγt（视黄酸相关孤儿受体γt）、Thy1（CD90.2）和NKp46等标志分子。有趣的是，受体小鼠的性别并不影响MNK3的定植效率，这为实验设计提供了更大的灵活性。

MNK3抵御肠道感染的能力

在功能验证实验中，研究人员发现移植后的MNK3细胞保持了产生IL-22和CSF2的能力。当用Citrobacter rodentium（啮齿柠檬酸杆菌）感染小鼠时，MNK3移植组小鼠表现出明显的保护效应：体重下降不明显，粪便和结肠组织中的细菌负荷显著降低，且成功阻止了细菌向肝脏和脾脏的扩散。这一结果证实MNK3细胞在体内能够执行原代ILC3的抗感染功能。

基因修饰MNK3适用于体内功能研究

研究团队进一步利用CRISPR/Cas9技术成功构建了Thy1、Il22和Csf2基因敲除的MNK3细胞系。通过电转染携带sgRNA和Cas9的质粒，他们成功获得了CD90.2表面标志缺失的MNK3^Thy1-/-细胞系，以及IL-22和CSF2分泌缺陷的MNK3^Il22-/-和MNK3^Csf2-/-细胞系。这些基因修饰的细胞系在移植到免疫缺陷小鼠体内后，仍然保持其敲除表型，为研究特定基因功能提供了可靠工具。

ILC3来源的CSF2加剧无菌性炎症中的肠道损伤

研究人员利用吲哚美辛诱导的肠道炎症模型，探究了ILC3来源的CSF2在炎症过程中的作用。结果显示，移植MNK3细胞的小鼠在吲哚美辛处理后表现出明显的肠道炎症症状，包括肉眼可见的肠道损伤、疼痛表现和粪便中脂钙蛋白2（Lcn-2）水平升高。而移植MNK3^Csf2-/-细胞的小鼠则几乎不出现这些炎症表现。进一步机制研究发现，CSF2的存在促进了中性粒细胞在肠固有层的浸润和聚集，并增加了肠道上皮细胞的凋亡水平。

CSF2促进稳态下单核细胞来源的CCR2⁺巨噬细胞

在稳态条件下，研究人员发现MNK3来源的CSF2显著促进了肠道、肝脏和脾脏中髓系细胞的发育。移植MNK3细胞的小鼠表现出CD11b⁺CD64⁺巨噬细胞数量的显著增加，特别是单核细胞来源的CCR2⁺巨噬细胞亚群。在肝脏中，CSF2不仅促进了CCR2⁺单核来源巨噬细胞的发育，还增加了CD206^hiTim-4⁺库普弗细胞（KC2）的数量。这些效应在移植MNK3^Csf2-/-细胞的小鼠中均未出现，证实了CSF2的关键作用。

为了验证这一发现在生理条件下的相关性，研究人员进一步分析了Rag2^-/-小鼠（含有ILC但缺乏T、B细胞）肝脏中的CSF2产生细胞。他们发现肝脏中确实存在能够产生CSF2的ILC群体，包括自然杀伤（NK）细胞和NKp46^-的ILC3。与ILC完全缺失的Rag2^-/-Il2rg^-/-小鼠相比，Rag2^-/-小鼠肝脏中的CCR2⁺单核来源巨噬细胞和CD206^hiKC2数量更多，提示内源性ILC来源的CSF2确实在肝脏巨噬细胞稳态维持中发挥作用。

这项研究的结论部分强调，MNK3细胞系作为一个可靠且易操作的实验工具，成功模拟了原代ILC3细胞在体内的生物学功能。研究人员通过基因编辑技术证明，ILC3来源的CSF2在不同生理和病理状态下发挥着双重调节作用：在稳态下，它促进多个器官中单核细胞来源巨噬细胞的发育和维持；而在炎症状态下，它却加剧了组织损伤和炎症反应。

讨论部分进一步指出，这一研究平台的建立将极大促进ILC3生物学研究的发展。它不仅提供了一种经济高效的研究方案，避免了构建转基因动物的复杂性和高成本，而且使得更多实验室能够开展ILC3相关研究。更重要的是，这项研究揭示了ILC3-macrophage（巨噬细胞）轴在多个器官中的广泛存在和重要性，拓展了人们对天然免疫细胞网络调控机制的理解。

从转化医学视角来看，这项研究的发现为相关疾病的治疗提供了新思路。CSF2作为一把"双刃剑"，在不同语境下发挥着截然相反的作用，这提示我们在设计靶向CSF通路的治疗策略时需要考虑具体疾病背景。在抗感染免疫中，增强CSF2信号可能有利于宿主防御；而在慢性炎症性疾病中，抑制CSF2信号则可能带来治疗益处。

总之，这项研究通过技术创新解决了领域内的重要瓶颈问题，同时揭示了ILC3来源的CSF2在髓系细胞稳态调控中的新功能，为天然免疫细胞研究提供了有价值的工具和见解。