CRISPR/Cas9介导光滑双脐螺种系基因编辑：血吸虫病传播螺类遗传修饰的重大突破

本研究针对血吸虫病传播控制难题，首次成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对关键中间宿主光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata）进行种系基因编辑。研究人员通过建立胚胎去囊体外培养（EOC）体系，靶向敲除纤维蛋白原相关蛋白3.1（FREP3.1）基因并获得稳定遗传的纯合突变株系。尽管FREP3.1敲除未改变螺类对曼氏血吸虫（Schistosoma mansoni）的易感性，但该研究成功建立了螺类基因编辑技术平台，为发展基于基因驱动的血吸虫病控制策略奠定了关键技术基础。

　　

血吸虫病作为一种古老的寄生虫病，至今仍在全球范围内困扰着约2.4亿人口，特别是在医疗资源匮乏的发展中国家。这种疾病的传播链中有一个不可或缺的环节——淡水螺类。它们作为血吸虫的中间宿主，为寄生虫提供了发育场所，没有这些螺类的参与，血吸虫就无法完成其生命周期，疾病也就无法传播。然而，当前的血吸虫病防治主要依赖吡喹酮这一单一药物，该药物对幼龄血吸虫无效，且无法预防再次感染，更令人担忧的是，目前尚无有效的疫苗问世。

面对这一困境，科学家们将目光投向了传播环节的控制。如果能通过遗传手段改造这些媒介螺类，使其不再支持血吸虫的发育，就有可能从源头上阻断疾病传播。这一设想虽然美好，但实现起来却面临着巨大挑战。历经四十多年的探索，研究人员始终未能在血吸虫病媒介螺类中实现种系基因修饰。这主要归因于螺类独特的生殖生物学特性：它们雌雄同体，体内受精，胚胎被包裹在充满营养液的胶囊中，这些特征使得传统的基因操作技术难以施展。

近日，一项发表于《科学进展》（SCIENCE ADVANCES）的研究打破了这一僵局。研究团队成功利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，在国际上首次实现了对重要血吸虫病媒介——光滑双脐螺（Biomphalaria glabrata）的种系基因编辑，为血吸虫病的遗传控制策略带来了曙光。

研究团队建立了一套完整的技术体系，包括胚胎去囊、显微注射、体外培养等关键步骤。他们使用实验室长期培育的BS90品系光滑双脐螺和曼氏血吸虫PR1品系进行实验。通过体外转录合成Cas9 mRNA和引导RNA（gRNA），采用特制的显微注射系统将编辑组件导入去囊后的早期胚胎。创新性地利用玻璃毛细管进行胚胎体外培养（EOC），并添加天然胶囊液作为营养支持，成功将编辑后的胚胎培养至孵化。

研究人员选择纤维蛋白原相关蛋白3.1（FREP3.1）基因作为首个编辑靶点。该基因属于FREP基因家族，某些成员已知在螺类对抗寄生虫的免疫防御中发挥作用。通过5′和3′末端快速扩增（RACE）技术，团队首次获得了FREP3.1基因的完整转录本序列，为后续的gRNA设计奠定了基础。

表达外源EGFP在光滑双脐螺胚胎中

通过将增强型绿色荧光蛋白（EGFP）mRNA导入去囊胚胎，研究人员验证了显微注射技术的有效性。在单细胞期或双细胞期注射后，胚胎能够正常表达EGFP荧光，且荧光信号在胚胎发育过程中持续存在。当在双细胞期仅注射其中一个卵裂球时，荧光表达仅限于该卵裂球的后代细胞，证明这是特异性的外源基因表达而非自发荧光。

显微注射后去囊胚胎的体外培养

研究团队成功建立了去囊胚胎的体外培养体系。注射后的胚胎在玻璃毛细管中能够完成从原肠胚、担轮幼虫到幼螺的整个发育过程。幼螺孵化后转移至人工池塘水（APW）中继续生长发育，最终发育为成螺。整个体外培养过程的平均成功率约为20%，为后续的基因编辑研究提供了可靠的技术支持。

CRISPR/Cas9介导的FREP3.1基因敲除

在技术条件成熟后，研究人员将Cas9 mRNA与靶向FREP3.1基因第一外显子的gRNA共同注射入胚胎。通过异源双链泳动分析（HMA）技术，在G₀代幼螺中成功检测到基因编辑事件。进一步的遗传分析表明，这些编辑事件能够稳定遗传给后代。研究人员最终获得了两个不同的纯合突变株系：del4/del4和del10/del10，分别携带4个和10个核苷酸的缺失突变。这些突变株系在生长发育、繁殖能力等方面与野生型螺类无显著差异。

评估FREP3.1敲除对BS90螺类血吸虫发育的影响

为验证FREP3.1基因在抗血吸虫感染中的功能，研究团队进行了四次独立的感染实验。结果显示，两个FREP3.1敲除株系与野生型BS90螺类一样，均表现出对曼氏血吸虫的完全抵抗性，而作为易感对照的iM品系则表现出高感染率。这一结果表明，单独敲除FREP3.1基因并不足以改变BS90螺类的抗性表型。

这项研究的成功具有里程碑式的意义。它不仅首次在血吸虫病媒介螺类中实现了CRISPR/Cas9介导的种系基因编辑，更重要的是建立了一套完整的技术平台，为后续的基因功能研究和遗传控制策略开发奠定了坚实基础。尽管FREP3.1基因的敲除并未改变螺类对血吸虫的易感性，但这可能反映了FREP基因家族的功能冗余性或补偿机制。该研究为未来开发更有效的基因驱动系统，从而从根本上控制血吸虫病的传播提供了可能。随着技术的不断完善，遗传修饰的媒介螺类有望成为控制血吸虫病传播的有力工具，为全球血吸虫病防治事业带来新的希望。