综述：基于CRISPR的平台在临床样本中检测肿瘤相关遗传物质

本综述系统评述了CRISPR/Cas系统在肿瘤相关遗传物质检测中的突破性进展。该技术凭借其可编程性、快速反应、高靶向特异性及信号放大能力，成功应用于基因突变、DNA甲基化、miRNA、lncRNA和circRNA等靶标的检测，为癌症早期筛查、诊断和治疗监测提供了创新工具。

　　

ABSTRACT

肿瘤相关遗传标志物在癌症早期筛查、诊断和治疗监测中具有重要价值。然而传统检测方法存在操作流程复杂、耗时较长且设备成本高昂的局限性。CRISPR/Cas系统凭借其可编程性（programmability）、快速反应特性、高靶向特异性以及信号放大能力，正成为肿瘤检测领域新兴的重要工具。该技术已在基因突变、DNA甲基化（DNA methylation）、微小核糖核酸（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）等肿瘤相关遗传物质的检测方面取得突破性进展。本文系统评述了这些技术突破，并阐述了各CRISPR/Cas系统检测肿瘤相关遗传物质的核心机制，同时强调了这些标志物在癌症诊断与预后评估中的重要临床意义。

CRISPR技术平台的核心优势

CRISPR/Cas系统在分子诊断领域展现出革命性优势。其可编程性允许通过设计向导RNA（guide RNA）精准识别特定核酸序列，Cas蛋白家族（如Cas9、Cas12、Cas13）则提供多样化的检测能力。Cas12a与Cas13a蛋白在靶向识别后分别表现出反式切割DNA和RNA的活性，这种特性被巧妙应用于信号放大系统。与传统PCR和测序技术相比，CRISPR检测平台能够在恒温条件下完成反应，大幅简化操作流程并缩短检测时间至1小时以内。此外该技术对设备要求较低，有望实现现场快速检测（point-of-care testing），特别适用于临床样本的即时检测。

基因突变检测应用

在肿瘤基因突变检测方面，CRISPR/Cas9系统通过精密设计的sgRNA可准确识别单核苷酸多态性（SNP）和基因融合事件。研究人员将CRISPR技术与重组酶聚合酶扩增（RPA）结合，成功实现了对肺癌EGFR基因T790M突变、结直肠癌KRAS基因突变等高发突变的超灵敏检测。Cas12系列蛋白在双链DNA识别后激活的反式切割活性，可用于水解荧光报告基团，实现可视化的突变检测，检测灵敏度达到阿摩尔级别（10^-18M）。

表观遗传学检测突破

DNA甲基化（DNA methylation）作为重要的表观遗传学修饰，与肿瘤发生发展密切相关。CRISPR/dCas9系统通过与甲基化敏感蛋白（如MBDP）融合，实现了特定基因启动子区域甲基化状态的精准识别。新开发的dCas9-TET1融合蛋白可催化DNA去甲基化反应，为定量检测低甲基化水平提供了新方法。这些技术进步使得循环游离DNA（cfDNA）中肿瘤特异性甲基化模式的检测成为可能，为癌症早期诊断提供了新途径。

非编码RNA检测创新

非编码RNA分子在肿瘤调控网络中发挥关键作用。Cas13系统对RNA分子的特异性识别能力，使其成为检测微小RNA（miRNA）、长链非编码RNA（lncRNA）和环状RNA（circRNA）的理想工具。通过设计特异性crRNA，研究人员实现了对肺癌标志物miR-21、肝癌相关H19 lncRNA以及胃癌中circPVT1的高灵敏度检测。Cas13a在靶向结合后激活的 collateral cleavage 活性可放大检测信号，结合侧流层析试纸条（lateral flow strip）可实现肉眼可视化的结果判读。

临床转化与展望

CRISPR检测技术在临床样本应用方面取得显著进展，已成功应用于血清、组织活检和液体活检样本的检测。通过微流控芯片与CRISPR技术的整合，实现了多靶标并行检测的自动化平台。然而该技术向临床常规应用的转化仍面临挑战，包括提高检测特异性以减少脱靶效应、简化核酸提取流程以及建立标准化质控体系。未来随着Cas蛋白工程改造和信号放大策略的优化，CRISPR检测平台有望成为癌症精准诊断的重要工具，推动肿瘤早期筛查和个体化治疗的发展。