综述：利用节段培养技术实现难再生园艺作物的高效再生及CRISPR/Cas基因组编辑

本综述系统阐述了节段培养（Nodal culture）这一植物组织培养技术在解决难再生园艺作物（如 Garcinia mangostana, Artocarpus heterophyllus 等）再生难题中的关键作用。文章详细介绍了该技术的操作流程、再生效率，并深入探讨了其背后的生化机制（如活性氧ROS的作用）和分子调控网络（涉及WUS、CUC1/2、LBD16等关键转录因子）。特别指出，节段培养与CRISPR/Cas基因编辑系统及快速育种（Speed breeding）技术的结合，为这些作物的遗传改良和性状定向培育提供了高效平台，有望克服传统转化中的再生障碍，推动可持续农业发展。

　　

引言

难再生作物，其种子通常具有高含水量（30-70%），对低温敏感，种子活力极易在短期内丧失，这给其繁殖和遗传改良带来了巨大挑战。传统的组织培养方法在这些作物中往往效率低下。节段培养技术利用其节间和顶端分生组织细胞分裂旺盛、全能性高的特点，且含水量相对较低，为解决难再生作物的脱水和微生物污染等问题提供了有效途径。

节段培养方案及其在难再生园艺作物中的反应

节段培养方案涉及使用无菌的未成熟节段作为外植体。外植体经过清洁剂（如Tween 20）和消毒剂（如羧苯并咪唑、链霉素、乙醇、次氯酸钠）的严格表面消毒后，接种到添加了精确配比生长调节剂（主要是生长素和细胞分裂素）的培养基（如MS、WPM、DKW）中，在受控环境下诱导再生。再生芽可转移到含生长素（如0.1-2 mg/L）的根诱导培养基中生根。再生植株随后在泥炭和珍珠岩（2:1）的混合物中进行驯化，逐步适应外界环境。该技术已成功应用于多种难再生物种的再生，但其再生反应因物种、培养基成分和生长调节剂浓度而异。

节段培养中植物再生的生化机制

未成熟节段外植体合成多种生物分子，包括生物碱、萜类以及初级和次级代谢产物，这些物质在调节再生过程中起着关键作用。活性氧（ROS）在再生过程中扮演着积极的调节角色，刺激程序性细胞死亡、植物激素信号传导和细胞分裂等关键生理和分子过程。优化培养条件（如培养基成分、温度、光周期和植物生长调节剂PGRs浓度）可以显著促进次级代谢物的合成，从而支持组织活力和再生。

植物再生的细胞机制

外植体的解剖结构因物种而异。在节段外植体中，特定的组织可能有助于再生过程。调控细胞分化、去分化和转化的转录因子（TFs）在此过程中起着核心作用。例如，WUSCHEL-RELATED HOMEOBOX 11和12（WOX11/12）驱动起始细胞分裂，而WOX5则促进起始细胞向未分化的薄壁细胞转化，促进愈伤组织形成。

难再生园艺作物再生的基因调控机制

生长素和细胞分裂素的精确应用及其比例对节段培养中的再生至关重要。高生长素浓度有利于根的形成，而高细胞分裂素水平则促进芽的再生。关键的转录因子如WUSCHEL（WUS）、Enhancer of Shoot Regeneration 1（ESR1）、Cup-shaped Cotyledon 1和2（CUC1, CUC2）调控芽的再生。而Lateral Organ Boundaries Domain 16和29（LBD16, LBD29）、WOX11、WOX12和WOX5等则影响生长素调节的根发育。伤口诱导的转录因子如WIND1以及组蛋白修饰（如H3K9/14乙酰化和H3K27甲基化）也参与调节愈伤组织形成和伤口反应。

节段培养与快速育种技术在难再生园艺作物中的整合

快速育种（Speed breeding）利用受控环境加速植物生长。节段培养提供快速、无性繁殖的能力。将两者整合，可以利用节段培养产生健康、均匀的植株，然后转移到快速育种室中，通过优化光周期、光强度和CO₂浓度等因素，加速生长和开花，从而显著缩短育种周期，实现快速性状选择和遗传改良。

节段培养与CRISPR/Cas基因编辑系统的整合

CRISPR/Cas系统提供了精确的基因编辑工具。在传统组织培养转化效率低的难再生作物中，节段培养为CRISPR/Cas介导的遗传修饰提供了一个有效的平台。通过将CRISPR/Cas构建体导入无菌的未成熟节段，并在优化的培养基上诱导再生，可以筛选获得非嵌合体的转基因植株，用于开发具有增强性状（如抗逆性、生物强化）的品系。

难再生园艺作物节段培养面临的挑战

节段培养在难再生作物中的应用面临诸多挑战，包括芽和根诱导率低、基因型依赖性、需要精确的激素平衡、体细胞克隆变异、外植体褐化、驯化困难、关键生长调节剂稀缺、外植体生理年龄影响、遗传变异以及技术问题（如灭菌困难、污染、培养基优化）。内生菌污染尤其难以消除。制定合适的培养基配方也是一项关键挑战。

结论

节段培养作为一种先进的植物组织培养技术，在受控条件下再生多种植物物种方面已显示出巨大潜力。然而，其与CRISPR/Cas等基因编辑平台的整合在难再生作物中仍然有限。将节段培养与基因组编辑、快速育种以及合成生物学工具相结合，为改善这些作物的再生和遗传转化提供了变革性途径。未来的研究需要探索低体外反应性物种的再生潜力，阐明限制再生能力的分子和表观遗传障碍，并优化物种特异性方案，以充分发挥节段培养在可持续农业和粮食安全方面的潜力。