基于CRISPR-Cas12a系统驱动的新型电化学发光共振能量转移生物传感器用于循环肿瘤DNA检测

本推荐语：本研究创新性地构建了以Ru(phen)32+/AuNCs为供受体对的电化学发光共振能量转移（ECL-RET）体系，结合CRISPR-Cas12a系统的高特异性基因编辑能力，开发了无需电极修饰的均相生物传感器。该技术实现了对非小细胞肺癌患者ctDNA中L858R突变的高灵敏检测（检测限达3.0 fM），为肿瘤液体活检提供了新型快速检测平台。

　　

Reagents and apparatus

本研究关键酶组分LbaCas12a（Cas12a）和DNase I均购自中国苏州Novoprotein Scientific公司。所有合成寡核苷酸及Tris(2-羧乙基)膦盐酸盐（TCEP-HCl）由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，具体序列详见表1。ECL检测采用两套互补系统：上海辰华CHI660D电化学分析仪与日本日立公司超灵敏光电倍增管组装的检测平台，以及配备420 nm滤光片的BPCL超弱化学发光分析仪（北京滨松光子技术股份有限公司）。

Principle of the proposed ECL-RET biosensor

如Scheme 1机理框架所示，该CRISPR驱动的ECL-RET生物传感器架构与信号转换通路系统性地揭示了工作原理：首先将Cas12a蛋白与crRNA混合形成Cas12-crRNA二元复合物，目标DNA序列被设计为CRISPR-Cas12a系统的激活链。当无目标存在时，该复合物对AuNCs表面修饰的S1链无切割活性。此时通过dsDNA模板引导Ru(phen)₃²⁺嵌入双链沟槽，由于供受体间发生高效ECL-RET导致信号淬灭。当存在目标ctDNA时，CRISPR-Cas12a系统被激活并对S1链进行反式切割，致使dsDNA模板解离，Ru(phen)₃²⁺从DNA沟槽中释放，ECL-RET效应中断从而实现信号恢复。这种"激活-切割-释放"的级联反应实现了对目标DNA的超灵敏检测。

Conclusions

本研究成功构建了基于CRISPR-Cas12a系统的高灵敏度均相ECL-RET传感平台，以Ru(phen)₃²⁺和AuNCs作为ECL-RET系统的能量供受体对。该生物传感器消除了ECL传感器构建时对电极表面核酸探针修饰的依赖，在ctDNA定量和变异等位基因频率检测方面展现出卓越的分析能力，其通过双盲临床试验验证的临床潜力已得到初步证实。