可编程crRNA变体工具箱：实现Cas12a功能灵活调控的新策略

本研究针对Cas12a系统缺乏灵活简便活性调控策略的问题，开发了通过crRNA直接重复序列（DR）突变构建的变体工具箱。研究人员通过系统突变DR区域获得具有不同活性的crRNA变体，成功实现了对Cas12a活性的精细调控，显著提升了其在基因表达调控、碱基编辑、原核生物同源重组编辑和核酸诊断等多场景下的性能。该研究为CRISPR-Cas12a系统的功能优化提供了简单高效的解决方案。

　　

CRISPR-Cas技术彻底改变了我们探索和修饰生物系统的方式，为核酸的快速识别、编辑和操作提供了强大工具。其中，Cas12a作为广泛研究的II类/V型CRISPR-Cas核酸酶，在crRNA引导下以序列特异性方式结合并切割双链DNA（dsDNA），这一过程称为顺式切割，随后激活反式切割活性，使Cas12a能够非特异性地切割周围单链DNA（ssDNA）。Cas12a具有T富集靶向、高特异性、短crRNA易于加工合成以及特征性反式切割活性等特点，使其在基因编辑和核酸诊断领域得到广泛应用。

然而，目前缺乏一种兼具灵活性和简便性的活性调控策略，使Cas12a能够适应不同应用场景的多样化需求。现有的策略主要通过对CRISPR组件进行修饰，包括蛋白质工程开发增强型突变体（如hyperCas12a和enAsCas12a）和crRNA修饰策略（如添加7-mer DNA延伸、掺入2-氨基腺嘌呤或截断/拆分crRNA）。虽然这些方法在调控Cas12a核酸酶活性或提高特异性方面取得了成功，但在灵活性和简便性方面仍面临挑战。

针对这一技术瓶颈，中国科学技术大学的研究团队在《Nature Communications》发表了创新性研究成果。他们以来自Lachnospiraceae bacterium ND2006的LbCas12a为例，系统探索了crRNA直接重复（DR）序列突变对Cas12a活性的影响，利用DR构建的简便性和天然多样性，通过高通量筛选构建了突变体工具箱，并在体外表征验证了这些突变体赋予Cas12a的不同特性。

研究人员采用的主要技术方法包括：crRNA DR突变库构建与高通量筛选、表面等离子共振（SPR）分析结合亲和力、电泳迁移率变动分析（EMSA）评估DNA结合 affinity、顺式和反式切割活性表征、细菌CRISPRi系统验证基因抑制效率、碱基编辑效率评估、同源重组介导的基因组编辑以及RPA-CRISPR一体化检测技术。临床样本来源于福建医科大学附属协和医院收集的55例痰液和肺抽吸物样本。

crRNA DR突变库的构建与筛选

研究人员将Cas12a crRNA的DR序列划分为三个部分——茎部、环部和侧翼序列，并分别构建了饱和突变库。通过高通量表征这些crRNA突变体的活性，他们开发了CRISPRi系统，其中dCas12a由crRNA突变体引导来抑制gfp表达。crRNA活性表现出多样性，相对表达水平从31.8%到110.1%不等，初步证实DR突变是获得易于调控且具有多样化活性的核糖核蛋白（RNP）的有效方法。

从288个筛选出的突变体中，研究人员选择了6个具有不同抑制活性的突变体，与经典crRNA一起形成了"crRNA工具箱"。两个侧翼序列突变体被命名为"F1"和"F2"，两个环部突变体被命名为"L1"和"L2"，两个多部分突变体被命名为"FL1"和"FL2"。

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crRNA工具箱引导的Cas12a可调活性

通过表面等离子共振（SPR）分析评估Cas12a与crRNA的结合亲和力，发现虽然存在轻微变化，但差异保持在两倍范围内，表明结合亲和力相对相似。这些结果表明，LbCas12a对crRNA中DR区域突变具有相对较高的耐受性。

使用电泳迁移率变动分析（EMSA）表征了与crRNA形成RNP复合物后dCas12a对靶dsDNA的亲和力。经典crRNA在引导dCas12a结合靶dsDNA方面表现出优异能力，而crRNA突变体的结合能力各不相同，其中F1和F2对靶dsDNA的亲和力最高，L1和L2次之，FL1和FL2结合最弱。

评估crRNA工具箱对Cas12a顺式切割活性的影响时，研究人员使用了由3'-FAM标记的非靶链（NTS）和5'-BHQ1标记的靶链（TS）组成的靶dsDNA报告系统。在简单实验室制备的Buffer-1条件下，FL1和L1引导的Cas12a未能产生可检测的顺式切割信号，而其他crRNA的活性顺序为：经典 > F2 > F1 > L2 > FL2。

在反式切割活性方面，研究人员使用了由FAM和BHQ1通过CCCCCCCC序列连接的ssDNA报告系统（称为8C ssDNA探针）。在靶dsDNA浓度相对较高（10 nM）时，除L1外，各crRNA产生相当的反式切割信号。但随着靶DNA浓度降低，crRNA工具箱展现出其多样性。

研究人员还表征了crRNA工具箱在区分靶dsDNA中点突变方面的特异性。使用在原型间隔序列每个位置有两个连续突变的dsDNA激活剂，测量了Cas12a引导的各crRNA突变体变体的反式切割荧光信号。每个突变crRNA变体引导的Cas12a特异性都不逊于经典crRNA，其中FL1、FL2和L1的荧光强度与完全匹配（PM）激活剂相比显著降低，表明这三个crRNA突变体表现出更高的特异性。

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可调基因抑制和精确碱基编辑

库筛选结果表明，突变DR序列可以将基于Cas12a的CRISPRi重塑为精细调控基因表达水平的工具。对于简化的crRNA工具箱，研究人员进行了更详细的表征以评估其提高CRISPRi可调性的潜力。

当使用强核糖体结合位点（RBS）时，L1、FL1和FL2引导的dCas12a相比经典crRNA引导的dCas12a受泄漏表达的影响较小。在没有诱导剂的情况下，这三种crRNA的相对GFP表达水平保持在约80%。当使用弱RBS时，L1和FL1未观察到泄漏抑制。

添加不同浓度（0、2、5和10 mM）的L-阿拉伯糖（L-ara）时，与经典crRNA相比，L1引导的dCas12a表现出更广的表达调控动态范围。靶基因的相对表达水平对诱导剂浓度变化更加敏感。在相同L-ara浓度下，crRNA工具箱实现了不同水平的表达抑制，相对gfp表达范围从98.59%到48.1%。

类似地，在碱基编辑方面，研究人员将大鼠来源的胞苷脱氨酶APOBEC或进化版本的七鳃鳗CDA（evoCDA）融合到dCas12a的N端，UGI融合到C端，并用crRNA工具箱的7个成员引导这些CBE。在一系列靶向大肠杆菌NEB 10-beta基因组中不同位点的编辑中，不同crRNA引导的CBE表现出不同的编辑窗口和C-to-T效率。

对于APOBEC-dCas12a-UGI，编辑窗口的宽度与C-to-T转换效率呈正相关，可能是由于crRNA突变引起的靶dsDNA亲和力变化所致。具体而言，低亲和力crRNA（如L1、FL2）倾向于产生更窄的窗口，而高亲和力变体（如经典、F1）支持更宽的窗口。虽然L1和FL2的编辑窗口从经典crRNA的8-13位点缩小到10-12位点，实现了更精确的编辑，但这是以降低编辑效率为代价的。

当与更高效的脱氨酶evoCDA配对时，与APOBEC表现不佳的crRNA突变体显示出改进的编辑效率。这表明使用高效脱氨酶可以使crRNA工具箱在保持编辑窗口控制的同时实现有效编辑。

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通过crRNA工具箱介导的同源重组增强基因组编辑

CRISPR介导的同源重组是原核生物中广泛使用的基因组编辑方法。CRISPR系统通过其顺式切割活性在染色体中诱导双链断裂（DSBs），然后使用外源修复模板（RT）通过同源重组进行修复，从而实现灵活的敲除、敲入和替换。

为了验证crRNA工具箱可优化CRISPR介导的同源重组的假设，研究人员将含有crRNA和RT的p15A质粒通过标准质粒转化试验导入携带Cas12a质粒的大肠杆菌NEB 10-beta中。靶序列在gfp内，目标是敲除500 bp片段或敲入1200 bp的mcherry基因。

对于除FL1外的大多数crRNA，转化子数量与其顺式切割效率呈负相关。当顺式切割效率低于某个阈值时，转化子数量激增两个数量级（L1、FL2），达到甚至超过非靶向对照的水平。降低Cas效应子的靶向强度可能为同源重组争取时间，从而增加细菌在DSB后存活的可能性。

使用侧翼基因组靶点并在同源臂外退火的引物进行菌落PCR，扩增子测序确认片段长度与成功的敲除和敲入相对应，编辑菌株的表型符合预期。在工具箱的六种crRNA突变体中，L1在敲除和敲入实验中均表现出优异性能。使用L1进行500 bp敲除和1200 bp敲入的效率分别达到58.3%和52.1%，分别是经典crRNA的13.8倍和2.5倍。

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crRNA工具箱促进的半定量一体化分子诊断

基于CRISPR的分子诊断通常依赖Cas蛋白识别和切割靶核酸，然后反式切割核酸探针产生信号。为确保高灵敏度，CRISPR诊断（CRISPR-Dx）通常与核酸扩增配对。然而，将扩增和CRISPR-Dx整合到一体化反应中对于简化工作流程和防止气溶胶污染至关重要。

研究人员以肺炎支原体为模型，利用crRNA工具箱开发了一种超简单的半定量一体化检测方法。他们选择了P1粘附素基因作为肺炎支原体核酸检测的常用靶标，并使用九种crRNA突变体（L1、L2、FL1、FL2、F1、F2以及高活性突变体L3和L4）来引导Cas12a进行靶标识别。

使用经典crRNA的一体化RPA-CRISPR-Dx导致相对较高的检测限（LoD）。相比之下，应用相对低活性的crRNA突变体显著提高了灵敏度，在30分钟内提供快速结果，每种突变体产生不同的LoD。具体而言，L1、FL2和F1的LoD分别为100 aM、10 aM和1 aM。值得注意的是，达到最低LoD的F1表现出与定量PCR（qPCR）相当的灵敏度。

为实现半定量检测，研究人员设计了一个包含三种不同LoD检测系统（L1:100 aM, FL:10 aM, F1:1aM）的阵列。这些系统同时应用于同一样本，阳性结果数量与靶核酸浓度相对应。单个阳性结果表示浓度在1-10 aM之间，两个阳性信号表示10-100 aM，所有三个阳性表示浓度超过100 aM。研究人员将这种方法命名为"基于非经典crRNA的半定量一体化CRISPR Dx"（SONAR）。

研究人员收集了55例临床痰液或肺抽吸物样本，使用经过验证的qPCR方法和SONAR方法进行测试。使用最灵敏的含F1检测系统对所有样本进行定性测试，40个阳性样本中有39个被F1系统报告为阳性，所有15个阴性样本均被确认为阴性，灵敏度为97.5%，特异性为100%。

研究结论与意义

本研究通过crRNA DR序列突变策略，成功开发了一个灵活调控Cas12a活性的工具箱。该工具箱不仅解决了Cas12a在不同应用场景中的活性调控问题，还显著提升了其在基因表达调控、碱基编辑、基因组编辑和分子诊断等方面的性能。

研究人员发现，DR突变通过影响Cas12a-crRNA RNP与靶dsDNA的结合亲和力，以及Cas12a的核酸酶活性本身，实现了对Cas12a功能的精细调控。crRNA工具箱的多样性使其能够适应各种复杂应用需求，从需要高精度的碱基编辑到需要高灵敏度的分子诊断。

在CRISPRi应用中，crRNA工具箱有效缓解了泄漏抑制问题，提供了更精确和可调的表达抑制。在碱基编辑中，通过选择适当的crRNA变体，可以实现从宽编辑窗口到窄编辑窗口的灵活调控，满足不同精度需求的编辑任务。在基因组编辑中，活性减弱的crRNA变体显著提高了转化效率和编辑效率，为原核生物基因组编辑提供了更有效的工具。在分子诊断中，crRNA工具箱使一体化检测成为可能，实现了快速、准确、半定量的核酸检测，为POCT应用提供了理想解决方案。

该研究的创新之处在于提供了一种简单、灵活且高效的Cas12a活性调控策略，无需复杂的蛋白质工程或化学修饰，仅通过crRNA序列的合理设计即可实现功能的多样化调控。这种策略不仅扩展了CRISPR-Cas12a系统的应用范围，也为其他CRISPR系统的功能优化提供了新思路。

未来研究方向包括将crRNA工具箱与工程化Cas12a、脱氨酶和其他调控蛋白整合，进一步扩展其应用潜力。同时，探索DR突变策略在其他Cas效应子（如Cas9和Cas13）中的普适性，也将为CRISPR技术的进一步发展提供重要支持。

总之，crRNA DR突变策略以其可调节性、可控性、灵活性和易用性，为Cas效应子调控提供了强有力的补充方法，有望在生命科学和医学研究领域发挥重要作用。