靶向单倍致死基因座的基因驱动锚定位点工程：增强疟蚊抗性管理的创新策略

为解决基因驱动中抗性等位基因演化问题，研究人员在冈比亚按蚊中开发了靶向单倍致死基因座RpL11-Rpt1的基因驱动锚定位点dRP/dRPi。通过HACK技术成功构建了携带重编码序列和ΦC31 RMCE对接位点的工程株系，证实可支持驱动样转基因插入。虽然未实现驱动，但为开发抗演化稳健的基因驱动系统提供了关键工具，并揭示了靶向单倍致死位点的重要挑战。

　　

在对抗蚊媒传染病的斗争中，基因驱动技术被誉为革命性工具，它能够通过超孟德尔遗传的方式在种群中快速传播抗病或绝育性状。然而，该技术面临一个根本性挑战：CRISPR切割后通过末端连接修复产生的抗性等位基因会阻止驱动元件传播，最终导致驱动系统崩溃。特别是在疟疾主要传播媒介冈比亚按蚊中，已开发的基因驱动系统都不同程度地出现了抗性问题。

为解决这一难题，研究人员将目光投向单倍致死基因座——这类基因的特点是只要一个等位基因失活就会导致细胞死亡。理论上，若将基因驱动插入这类位点，任何因CRISPR切割产生的功能丧失型抗性等位基因(r2)都将被自然选择清除，而功能保持型抗性等位基因(r1)则能在驱动元件传播过程中被同源定向修复(HDR)机制删除。这种设计被称为进化稳定归巢基因驱动(ESHGD)，它通过在单倍致死基因的3'末端引入重编码序列和替代3'UTR，创造出一个与野生型染色体无同源性的区域，确保只有成功的驱动归巢才能让细胞存活。

在这项发表于《Scientific Reports》的研究中，Smidler等人报告了他们在冈比亚按蚊中开发两种基因驱动对接株系的突破性工作。研究人员选择了核糖体-蛋白酶体基因对RpL11-Rpt1作为靶点，其中RpL11是单倍致死性的核糖体亚基，而Rpt1是可能单倍充足的蛋白酶体调控粒子亚基。他们设计了两种对接位点：dRP旨在保持两个基因的功能，支持传统的群体置换驱动策略；dRPi则通过省略Rpt1的3'UTR来抑制蛋白酶体功能，创造隐性致死替代(RLR)驱动设计，既能实现群体置换又能产生50%的种群抑制效果。

研究采用了几项关键技术：利用同源辅助CRISPR敲入(HACK)技术在生殖系中实现靶向整合，避免了直接胚胎注射CRISPR组件靶向单倍致死基因的致死性问题；使用ΦC31重组酶介导的盒交换(RMCE)技术精确插入驱动样转基因；通过Western blot、qRT-PCR和表型分析等手段全面评估工程株系的分子和表型特征。

研究结果方面，基因驱动对接位点的设计与构建显示，研究人员成功设计了dRP和dRPi两种对接位点，包含RpL11和Rpt1 C末端序列的重编码、替代3'UTR和ΦC31 attP位点。通过HACK实现生殖系整合证实，利用携带8个gRNA和同源臂的piggyBac供体转基因，研究人员在生殖系中成功实现了dRP和dRPi向 endogenous RpL11-Rpt1位点的靶向整合，发现当供体与靶位点位于同一染色体时整合效率最高。

dRPi表征与驱动样转基因插入证明，将包含gRNA表达盒的驱动样转基因gDLT通过RMCE插入dRPi位点后，dRPi纯合子表现为早期幼虫致死，并显示多聚泛素化聚集，证实了蛋白酶体功能丧失；而插入的gDLT转基因(12.5 kB)表明该对接位点能够容纳基因驱动规模的大片段插入。

驱动失败归因于致死性和不育性显示，尝试将表达Cas9的完整基因驱动构建体插入对接位点时，所有转基因个体都在一龄幼虫期死亡，表明该位点对Cas9过表达敏感；在分裂驱动样设计中提供反式Cas9时，驱动基因型个体表现为完全不育或死亡，表明需要精细调控CRISPR表达。

dRP纯合子为核糖体Minute突变体意外发现，dRP纯合子虽然设计为保持两个基因功能，但实际上表现出发育延迟、体型变小和繁殖障碍等核糖体Minute突变体表型；RpL11 mRNA水平显著降低，但Rpt1表达正常且无多聚泛素化聚集，表明问题特异于核糖体功能而非蛋白酶体。

研究表明，虽然未能实现基因驱动，但这项工作在开发抗性管理的基因驱动系统方面取得了重要进展。研究人员成功建立了基因驱动对接株系，证明了HACK技术在工程化遗传难治位点方面的效用，并揭示了靶向单倍致死位点面临的关键挑战。这些发现对在按蚊及其他后生动物中开发稳健基因驱动系统具有重要指导意义。

核糖体Minute表型的意外发现表明，重编码或替代3'UTR可能影响了基因的正常调控，提示未来需要优化重编码策略以减少对基因功能的影响。同时，Cas9表达的毒性效应表明需要开发更精细的调控系统，如绝缘子、密码子去优化或诱导系统等。

这项研究为开发真正抗演化的基因驱动系统奠定了基础，虽然面临挑战，但为解决基因驱动技术中最棘手的抗性问题提供了切实可行的路径。未来通过优化重编码策略、精细调控Cas9表达以及可能提供额外的重编码RpL11转基因拷贝来缓解Minute表型，这些对接株系有望支持强大基因驱动系统的实现，最终为疟疾控制提供创新解决方案。