CRISPR-MI与scRNA测序揭示TREM2在腹主动脉瘤形成过程中调控单核细胞浸润和巨噬细胞凋亡的双重功能

本刊推荐：本研究创新性开发了体内全基因组CRISPR/Cas9单核细胞浸润筛选技术（CRISPR-MI），结合单细胞RNA测序（scRNA-Seq），首次揭示TREM2在腹主动脉瘤（AAA）发病过程中具有双重调控作用：早期抑制单核细胞浸润（通过ERK通路调控黏附分子表达），晚期促进巨噬细胞存活（通过SYK信号通路）。该发现为靶向TREM2的AAA治疗策略提供了重要理论依据。

　　

1 引言

腹主动脉瘤（Abdominal Aortic Aneurysm, AAA）是一种危及生命的主动脉疾病，其特征是腹主动脉局部扩张（直径＞3 cm或超过正常50%）。作为仅次于动脉粥样硬化的第二大主动脉疾病，AAA在75-84岁人群中的患病率高达12.5%，是全球第九大死亡原因。当前AAA治疗主要依赖开放性手术或血管内动脉瘤修复，缺乏有效药物治疗方案。

单核细胞向主动脉壁的浸润是AAA发展的关键环节。这一多步骤过程包括：选择素介导的初始栓系和滚动（L-选择素、P-选择素、E-选择素）、整合素激活介导的稳固黏附（LFA1-ICAM1、VLA4-VCAM1），以及通过连接粘附分子（JAM家族、PECAM-1、CD99）的跨内皮迁移。多种趋化因子受体（CCL2-CCR2、CX3CL1-CX3CR1、CCL3/CCL5-CCR1/CCR5）参与调控此过程。然而，靶向单核细胞浸润的心血管疾病治疗药物仍属空白。

CRISPR/Cas9基因组编辑系统为生物学过程研究提供了强大工具。与传统shRNA筛选相比，CRISPR-Cas9能够实现基因完全敲除且脱靶事件更少。但其应用受限于需要大量突变细胞库和可靠筛选程序，通常只能在体外或异种移植模型中完成。为克服这一局限，本研究开发了体内全基因组CRISPR-Cas9单核细胞浸润筛选技术（CRISPR-MI），并将其应用于小鼠AAA模型。

2 实验结果

2.1 体内全基因组CRISPR-Cas9单核细胞浸润筛选技术（CRISPR-MI）的开发

研究团队通过优化原代骨髓源性单核细胞（BMDM）的慢病毒感染方案（使用Poloxamer synperonic F108佐剂，感染后48小时添加病毒），将感染效率提升至89.5%。采用Rosa26-Cas9转基因小鼠作为BMDM供体，确保基因组编辑效率（Cd300lf:60.57%, Lmnb1:85.39%, Mylip:37.82%）。通过体外分化5天的BMDM（保持Ly6C^high/F4/80^low单核细胞特性）进行过继转移，成功实现单核细胞向AAA模型小鼠主动脉的浸润。

2.2 CRISPR-MI鉴定调控小鼠AAA模型中单核细胞浸润的致病基因

使用全基因组sgRNA文库（Mouse Cherry Brie Pooled Library，78,637条gRNA对应19,674个基因）进行筛选。在AngII诱导的AAA模型中，主动脉内富集的sgRNA对应基因显著富集于未折叠蛋白反应、氧化磷酸化、mTORC1信号和TNFα-NF-κB通路。2516个基因（至少2条sgRNA，FDR＜0.05）被鉴定为阳性命中基因。对前11个候选基因（Abhd6、Ascl4等）的siRNA验证表明，其中10个基因的敲低可促进炎症（Tnf、Il1b、Il6、Il10）或M1巨噬细胞极化（Cd86、Cd80、Nos2）相关基因表达。

2.3 CRISPR-MI与scRNA-Seq联合鉴定TREM2为AAA单核细胞浸润的关键调控因子

整合scRNA-Seq数据发现，AAA小鼠主动脉巨噬细胞可分为三个亚群：Ccr2⁺ M1样、Mrc1⁺ M2样和Trem2⁺/Acp5⁺巨噬细胞。CRISPR-MI阳性基因显著富集于Mrc1⁺和Trem2⁺/Acp5⁺巨噬细胞标志基因集。通过多标准筛选（CRISPR-MI阳性、巨噬细胞亚群差异表达、AAA vs Control差异表达），最终确定8个核心基因：Trem2、Acp5、Tppp3、Ctsd、Tsc22d3、Tmem176b、Clec4d和Klf9。其中Trem2在巨噬细胞簇中表达最丰富且在AAA模型中显著诱导。

2.4 Trem2敲除促进BMDM黏附、迁移及AngII灌注后向主动脉浸润

体外实验表明，Trem2敲除（KO）BMDM与小鼠主动脉内皮细胞的黏附能力增强，向原代主动脉平滑肌细胞的迁移能力提高。在AAA模型中，AngII灌注3天和9天后，Trem2 KO小鼠主动脉中CD45⁺/CD11b⁺巨噬细胞数量显著增加，证实Trem2缺失促进早期单核细胞浸润。

2.5 Trem2敲除通过ERK激活增强BMDM中黏附和炎症基因表达

qPCR分析显示Trem2 KO BMDM中黏附分子（Sell、Fut4、Pecam1）、趋化因子受体（Ccr2、Ccr5、Cx3cr1）和细胞因子（Il1a、Il1b）表达显著上调。RNA-Seq和GSEA分析表明，Trem2 KO富集于ECM受体相互作用、黏着斑和细胞因子-细胞因子受体相互作用通路。Western blot证实Trem2 KO增强ERK磷酸化，ERK抑制剂（GDC-0994）可逆转Trem2 KO对Il1a、Il1b、Ccl5、Ccr1/2/5等基因的调控作用。

2.6 TREM2水平与人类AAA相关且其缺失在小鼠中发挥保护作用

AAA小鼠和患者血浆中可溶性TREM2（sTREM2）水平显著升高，且与小鼠主动脉直径呈正相关。人类AAA病变组织的WGCNA分析将TREM2定位为"黄色"模块枢纽基因，该模块富集于白细胞外渗和炎症通路。令人意外的是，Trem2 KO小鼠在AAA模型中表现出主动脉扩张减弱、弹性蛋白降解减少和巨噬细胞浸润降低，尽管其血浆胆固醇、血压和白细胞计数无变化。Trem2 KO血液中CD62L⁺/Ly6C^high单核细胞比例增加，且PBMC中炎症相关基因表达上调。

2.7 Trem2敲除促进血管内巨噬细胞凋亡

AngII灌注9天和28天后，Trem2 KO小鼠主动脉中凋亡巨噬细胞（CD45⁺/CD11b⁺/Annexin V⁺）显著增加。体外实验中，Trem2 KO BMDM培养7天后早期和晚期凋亡细胞增多，PARP和Caspase3切割增加。机制研究表明，Trem2 KO几乎完全 abolished M-CSF诱导的SYK磷酸化（Tyr519/520），但不影响CSF1R表达。过量M-CSF可挽救Trem2 KO导致的细胞死亡，自噬通路未见明显改变。

2.8 sTREM2过表达促进小鼠AAA发展

AAV8介导的sTREM2-Fc（Met1-His157与IgG1 Fc融合）过表达显著增加AAA小鼠的主动脉直径、发生率和夹层率，加重弹性蛋白降解和巨噬细胞浸润趋势，而不影响血脂和血压参数。这表明sTREM2在AAA发展中发挥 detrimental作用。

3 讨论

本研究开发的CRISPR-MI技术为研究单核细胞浸润相关疾病提供了强大工具。通过结合scRNA-Seq，成功鉴定出TREM2在AAA中的双重功能：在循环中维持单核细胞静息状态，在组织中保障巨噬细胞存活。这一发现解释了不同研究中Trem2 KO表型差异的矛盾结果——早期促进浸润与晚期增强凋亡的平衡决定了最终疾病结局。

TREM2通过ERK通路抑制单核细胞炎症状态，又通过TREM2/DAP12/SYK轴与M-CSF/CSF1R信号串话促进巨噬细胞存活。sTREM2过表达加重AAA的表型警示了TREM2激动剂在阿尔茨海默病治疗中潜在的心血管副作用，而TREM2拮抗剂可能成为AAA治疗的新策略，但需谨慎评估其神经系统影响。

4 结论

CRISPR-MI筛选揭示TREM2是单核细胞浸润的负向调控因子。Trem缺失通过ERK通路增强黏附分子、趋化因子受体和细胞因子表达，促进单核细胞募集；但浸润后的Trem2 KO巨噬细胞因SYK信号缺陷发生显著凋亡，最终减轻AAA表型。sTREM2过表达则产生相反效应。TREM2 thus represents a critical regulator of both monocyte extravasation and macrophage survival in AAA pathogenesis.

5 实验方法

研究使用Trem2敲除小鼠（C57BL/6J-Trem2^em2Adiuj/J）、Ldlr KO、Rosa26-Cas9和mTmG等转基因小鼠品系。通过AAV-PCSK9注射联合Western饮食和AngII灌注（1000-1500 ng kg^-1 min^-1，28天）建立AAA模型。采用优化慢病毒感染方案（F108佐剂，30 MOI）进行CRISPR-MI筛选，MAGeCK工具分析sgRNA富集。人类样本研究获中南大学湘雅医院和密歇根大学伦理委员会批准。