ScRNA-seq及实验分析揭示Lrg1通过调控氧化磷酸化途径影响脑缺血-再灌注后中性粒细胞的聚集

《Biocell》：ScRNA-seq and Experimental Analyses Unveil Lrg1 Regulating the Oxidative Phosphorylation Pathway to Affect Neutrophil Accumulation after Cerebral Ischemia-Reperfusion

中性粒细胞过度活化加剧脑缺血再灌注损伤炎症，Lrg1基因敲除通过调控氧化磷酸化途径增强微胶质吞噬能力，减少中性粒细胞积累，并降低ROS生成。

　　### 研究背景与意义

在缺血性脑卒中后，中性粒细胞会经历显著的激活和数量增加，从而加剧炎症反应，导致神经组织损伤。中性粒细胞的过度聚集不仅会引发局部炎症，还可能通过形成中性粒细胞胞外陷阱（NETs）进一步加重组织损伤。NETs是中性粒细胞在受到刺激后释放的一种免疫机制，能够捕获和杀伤病原体，但同时也可能对宿主细胞造成毒性作用。因此，调控中性粒细胞的积累和分化，对于减轻缺血性脑卒中后的炎症反应具有重要意义。

此前的研究通过单细胞RNA测序（scRNA-seq）技术发现，Lrg1在缺血再灌注损伤（ischemia-reperfusion injury）中扮演着关键角色。然而，其在调控中性粒细胞积累和分化方面的具体机制仍不清楚。本研究旨在通过Lrg1基因敲除小鼠模型，探讨Lrg1在缺血再灌注后对中性粒细胞清除过程的影响，特别是在微胶质细胞的参与下，Lrg1如何调节中性粒细胞的代谢活动和清除效率。

### 研究方法

本研究采用了多种先进的分子生物学和生物信息学技术，以全面解析Lrg1在中性粒细胞清除过程中的作用。首先，我们利用scRNA-seq技术对Lrg1敲除小鼠和野生型小鼠的脑组织进行了深入分析，以揭示不同细胞群体在缺血再灌注后的基因表达变化。通过基因集富集分析（GSEA），我们评估了氧化磷酸化等关键代谢通路在不同实验组中的富集情况。此外，我们还使用了CellChat软件包来分析细胞间的通讯模式，从而了解Lrg1如何影响中性粒细胞与微胶质细胞之间的相互作用。

为了进一步验证scRNA-seq的发现，我们还进行了免疫荧光染色和Western blot实验。这些实验帮助我们观察中性粒细胞和微胶质细胞在缺血再灌注后的空间分布和表达模式。通过这些实验，我们能够更直观地理解Lrg1在调控中性粒细胞清除中的具体作用。此外，我们还利用了三维重建技术，对免疫荧光染色结果进行了可视化分析，以研究中性粒细胞与内皮细胞、微胶质细胞之间的共定位现象。

### 研究结果

本研究的结果表明，Lrg1基因敲除显著降低了小鼠脑组织中中性粒细胞的积累，并抑制了NET的形成。通过三维免疫荧光重建，我们观察到中性粒细胞与内皮细胞、微胶质细胞存在明显的共定位现象，这提示它们之间可能存在某种互动。进一步的分析表明，Lrg1的缺失增强了微胶质细胞对中性粒细胞的吞噬能力，从而减少了中性粒细胞在缺血区域的滞留。

在代谢方面，Lrg1的缺失显著提高了微胶质细胞的氧化磷酸化得分，表明其可能通过调控这一代谢通路来增强吞噬能力。我们还发现，Lrg1的缺失导致了某些与吞噬相关的转录因子表达水平的升高，如Zmiz1、Foxp1、Irf8、Chd1、Hivep1、Maf、Foxo1、Mef2c和Nfkb1。这些转录因子的表达变化提示Lrg1可能通过影响这些关键分子的表达来调控微胶质细胞的吞噬功能。

此外，我们还评估了缺血再灌注后微胶质细胞的吞噬能力，通过CD68这一标志性分子的表达水平来衡量。结果显示，Lrg1的缺失显著提高了CD68的表达，这表明微胶质细胞的吞噬功能得到了增强。我们还观察到，CD68与TMEM119（微胶质细胞的标志性分子）存在共定位现象，进一步支持了微胶质细胞在中性粒细胞清除中的作用。

在能量代谢方面，我们发现Lrg1的缺失显著提高了微胶质细胞的ATP水平，并降低了缺血再灌注后氧化磷酸化相关蛋白的表达。例如，我们观察到NDUFB8、SDHB、UQCRC1、MTCO2和ATP5A1等蛋白的表达水平在Lrg1敲除小鼠中显著增加。这些蛋白是氧化磷酸化过程中的关键成分，其表达的增加可能表明Lrg1的缺失促进了这一代谢通路的激活，从而为微胶质细胞提供了更多的能量，使其能够更有效地吞噬中性粒细胞。

### 结论与展望

本研究的结论表明，Lrg1的缺失通过增强微胶质细胞的氧化磷酸化过程，显著提高了其对中性粒细胞的吞噬能力，从而减轻了缺血再灌注后的炎症反应。这一发现为未来研究提供了新的方向，即Lrg1可能是一个潜在的治疗靶点，通过调控微胶质细胞的代谢活动，可以有效干预缺血性脑卒中的炎症反应。

然而，本研究也存在一些局限性。首先，我们对微胶质细胞的分析主要依赖于scRNA-seq的生物信息学结果，而实验验证的范围有限。其次，尽管我们已经初步揭示了Lrg1在微胶质细胞吞噬功能中的作用，但其在中性粒细胞分化过程中的具体分子机制仍需进一步研究。未来的研究可以结合更多的实验手段，如CRISPR-Cas9基因编辑技术，以更精确地解析Lrg1的调控网络。

### 研究的意义与应用前景

本研究不仅揭示了Lrg1在调控中性粒细胞清除中的重要作用，还为缺血性脑卒中的治疗提供了新的思路。通过增强微胶质细胞的吞噬能力，Lrg1的缺失可能有助于减少中性粒细胞的积累，从而减轻炎症反应和神经损伤。这一发现可能推动针对Lrg1的药物开发，为缺血性脑卒中的治疗提供新的靶点。

此外，本研究还强调了微胶质细胞在维持中枢神经系统（CNS）稳态中的关键作用。微胶质细胞不仅能够清除中性粒细胞，还参与了多种神经炎症反应的调控。因此，理解微胶质细胞的代谢活动和吞噬功能，对于开发新的治疗策略具有重要意义。例如，通过调控氧化磷酸化通路，可以增强微胶质细胞的吞噬能力，从而减少中性粒细胞的积累和炎症反应。

综上所述，本研究为缺血性脑卒中的治疗提供了新的视角，即通过调控Lrg1来影响微胶质细胞的吞噬功能和代谢活动，可能成为一种有效的干预手段。未来的研究需要进一步验证这些发现，并探索其在临床中的应用潜力。