使用单壁碳纳米管作为递送载体过表达amh/或amhy基因会导致雌性 Mandarin 鱼的雄性化

《Water Biology and Security》：Overexpression of amh/ amhy using single-walled carbon nanotubes as delivery vehicles induces the masculinization of female mandarin fish

本研究利用功能化单壁碳纳米管（SWCNTs）作为载体，将pcDNA4.0-amh和pcDNA4.0-amhy质粒递送至Mandarin鱼性腺组织，成功诱导XX雌性鱼发生雄性表型，并通过双 luciferase 报告系统验证了amh和amhy通过Smad通路激活dmrt1基因的作用，为鱼类性别控制技术提供了新方法。

　　### 背景与研究意义

在中国的水产养殖业中，有一种被称为“ Mandarin fish”（ Mandarin 鱼）的经济鱼类，因其在市场上的高需求和良好的养殖特性而受到广泛关注。这种鱼在分类学上属于辐鳍鱼纲、鲈形目、石鲈科，广泛分布于中国、越南和韩国的河流中。Mandarin 鱼的雌性生长速度明显快于雄性，因此，为了提高养殖效益，许多养殖者倾向于培育全雌性种群。然而，这种选择性繁殖技术需要能够产生新的雄性个体（XX♂）作为父本，以确保种群的遗传多样性与繁殖能力。因此，研究如何有效地诱导全雌性 Mandarin 鱼向雄性转变，成为水产养殖领域的重要课题。

传统的鱼类性别控制方法主要依赖于外源性激素，如雌激素和雄激素。这些激素虽然在一定程度上可以影响鱼类的性别分化，但它们在水体中的残留可能会对其他鱼类造成干扰，甚至引发性别异常。例如，含有残留雄激素的池塘水会导致鲤鱼（Cyprinus carpio）的后代出现性别反转现象。因此，开发一种不依赖激素、更加环保和高效的性别控制技术显得尤为迫切。

近年来，随着基因工程技术的发展，利用基因表达调控进行鱼类性别控制成为一种新的研究方向。其中，AMH（抗穆勒氏管激素）和 AMHY（AMH 基因的同源变体）在鱼类性别决定和分化过程中发挥着关键作用。通过调控这些基因的表达，可以实现对鱼类性别的有效控制。然而，传统的基因传递方法如注射或饲料传递，存在操作复杂、成本高以及容易受到消化系统干扰等问题。因此，寻找一种更高效、更安全的基因传递方式，是当前研究的重点。

### 技术背景与研究方法

为了克服传统方法的局限性，本研究采用了一种新型的基因传递技术——功能化单壁碳纳米管（functionalized single-walled carbon nanotubes, SWCNTs）作为载体。SWCNTs 是一种具有优异物理化学特性的纳米材料，因其高比表面积、良好的生物相容性以及在细胞膜穿透方面的潜力，被广泛应用于生物医学和基因传递领域。功能化处理后的 SWCNTs 可以更有效地将 DNA 载体传递到目标组织，从而提高基因表达效率。

在本研究中，研究人员首先构建了 pcDNA4.0-AMH 和 pcDNA4.0-AMHY 两种表达载体。通过 PCR 技术，从 Mandarin 鱼的卵巢和睾丸组织中提取了 AMH 基因的编码序列，并将其插入到 pcDNA4.0 载体中，构建了相应的重组质粒。随后，这些质粒被与功能化 SWCNTs 进行结合，以提高其在鱼体内的传递效率。通过优化 SWCNTs 与质粒的连接比例，研究人员发现当连接比例为 20:1 时，质粒在鱼体内的传递效果最佳。

为了验证该技术的有效性，研究人员将全雌性 Mandarin 鱼幼鱼分为七个实验组，分别接受不同浓度的 SWCNTs-pcDNA4.0-AMH 处理。处理后，鱼体被转移至单独的水箱中，并在不同时间点采集肌肉和性腺组织进行分析。通过 PCR 和电泳技术，研究人员检测了质粒在鱼体内的存在情况，并进一步通过基因表达分析和组织学检查，评估了性别转变的效果。

### 研究结果与分析

在实验的早期阶段（7 天后），研究人员在 SWCNTs-pcDNA4.0-AMH-40 mg 组的肌肉和性腺组织中检测到了 pcDNA4.0-AMH 质粒的存在。这一结果表明，功能化 SWCNTs 能够有效地将质粒传递到目标组织中。此外，在 7 天和 14 天后，研究人员还检测到了 pcDNA4.0-AMH 在性腺组织中的转录活性，进一步证实了质粒在鱼体内的表达。

随着实验的推进，研究人员在 60、90 和 120 天后对性腺组织进行了组织学分析。结果显示，在 SWCNTs-pcDNA4.0-AMH-40 mg 组中，部分个体的性腺出现了雄性特征，如精原细胞（spermatogonia）、初级精母细胞（primary spermatocytes）和次级精母细胞（secondary spermatocytes）等。这些细胞的出现表明，经过 SWCNTs-pcDNA4.0-AMH 处理后，原本雌性的 Mandarin 鱼开始向雄性方向分化。此外，研究人员还观察到，部分个体的卵巢发育受到抑制，卵母细胞的数量显著减少，进一步支持了性别转变的发生。

在对 AMHY 的研究中，研究人员同样发现，SWCNTs-pcDNA4.0-AMHY-40 mg 组的个体在 90 天后也出现了雄性性腺结构。通过视觉判断和组织学分析，研究人员发现该组的雄性比例为 50.00%，而 SWCNTs-pcDNA4.0-AMH-40 mg 组的雄性比例为 66.67%。这表明，AMH 和 AMHY 都在性别决定和分化过程中发挥重要作用，但它们的表达效果有所不同。

为了进一步理解 AMH 和 AMHY 在性别决定中的作用机制，研究人员进行了双荧光素酶报告基因实验（dual-luciferase reporter assay）。实验结果显示，AMH 和 AMHY 能够通过 AMHRII/SMADs 通路激活 dmrt1 基因的启动子活性。这一发现表明，AMH 和 AMHY 通过调控 dmrt1 的表达，能够同时抑制雌性发育路径并促进雄性发育路径，从而实现雌性向雄性的性别反转。

### 研究意义与未来展望

本研究的成果具有重要的理论和应用价值。首先，它为鱼类性别控制技术提供了一种新的、非激素依赖的方法。通过使用功能化 SWCNTs 作为基因传递载体，研究人员能够在不依赖外源性激素的情况下，实现对鱼类性别的有效调控。这种方法不仅提高了基因传递的效率，还减少了对环境的潜在影响，为可持续水产养殖提供了新的思路。

其次，本研究揭示了 AMH 和 AMHY 在 Mandarin 鱼性别决定和分化过程中的关键作用。AMH 和 AMHY 通过激活 dmrt1 基因的启动子活性，能够显著影响性腺的发育方向。这一发现不仅加深了对鱼类性别调控机制的理解，也为未来开发更精确的性别控制技术奠定了基础。

此外，本研究还为水产养殖业提供了一种简单、高效且环保的性别控制方法。与传统的注射或饲料传递方法相比，SWCNTs-pcDNA4.0-AMH/AMHY 技术在操作上更为简便，且能够避免激素残留对环境和其他鱼类的干扰。这种方法的推广和应用，有望提高 Mandarin 鱼的养殖效益，同时促进水产养殖业的绿色发展。

### 技术优势与挑战

功能化 SWCNTs 作为基因传递载体的优势在于其高效性和安全性。相比传统的 DNA 疫苗或基因表达载体，SWCNTs 能够更有效地穿透细胞膜，将基因传递到目标组织中。此外，SWCNTs 的使用不仅提高了基因表达效率，还减少了对鱼体的刺激，使得实验过程更加温和。

然而，尽管 SWCNTs 在基因传递方面表现出色，但仍存在一些挑战。例如，SWCNTs 与质粒的连接比例需要进一步优化，以确保最佳的传递效果。此外，SWCNTs 在鱼体内的长期安全性仍需进一步研究，尤其是在大规模应用时，需要评估其对鱼类健康和生态环境的潜在影响。

### 未来研究方向

未来的研究可以进一步探索 SWCNTs 与质粒的连接比例优化，以提高基因传递效率。同时，研究人员还可以通过改变处理时间和浓度，评估不同条件对性别转变的影响。此外，为了确保该技术的安全性和可行性，需要进行更多的长期实验，以评估 SWCNTs 在鱼体内的代谢情况及其对鱼体健康的影响。

在性别调控方面，研究人员可以进一步探索 AMH 和 AMHY 的协同作用，以及它们与其他性别决定基因之间的相互关系。此外，还可以尝试将该技术应用于其他经济鱼类，以验证其普适性。通过这些研究，有望开发出更加精确和高效的性别控制技术，为水产养殖业提供更多的选择和解决方案。

### 结论

本研究通过功能化 SWCNTs 作为基因传递载体，成功实现了对 Mandarin 鱼性别调控的探索。实验结果表明，AMH 和 AMHY 在性别决定和分化过程中发挥着重要作用，能够通过激活 dmrt1 基因的启动子活性，促进雌性向雄性的转变。这一技术不仅为鱼类性别控制提供了新的方法，也为水产养殖业的绿色发展提供了技术支持。未来的研究将继续优化该技术，探索其在不同鱼类中的应用潜力，以及其对生态环境的潜在影响，以期实现更广泛的应用和推广。