Balb/c小鼠中，活疫苗与灭活NC-a株作为犬新孢子虫实验疫苗的保护性免疫反应比较

《Veterinary Parasitology》：Comparison of the protective immune response of Live vs. Inactivated NC-a strain as an experimental vaccine for Neospora caninum in Balb/c mice

牛弓形虫灭活疫苗佐剂优化及免疫效果评估。采用NC-a灭活疫苗联合铝佐剂和油佐剂，免疫Balb/c小鼠后检测生存率及免疫应答，结果显示G2组（油佐剂）与G4组（活疫苗）生存率均达90%，但灭活疫苗组在抗体及细胞免疫水平上与活疫苗相当且更安全稳定，证实灭活疫苗在牛弓形虫病防控中的可行性。

　　

马汀·科斯罗普尔（Matin Khosropour）|梅赫迪·纳马瓦里（Mehdi Namavari）|萨洛梅赫·希拉利（Salomeh Shirali）|扎赫拉·布托拉比（Zahra Bootorabi）|扎赫拉·卡巴赞（Zahra Khabazan）

伊朗德黑兰伊斯兰自由大学兽医学病理生物学科学系

摘要

开发有效的新生孢子虫病疫苗对于控制和治疗该疾病至关重要。我们之前的研究介绍了一种通过在J774细胞系上长期传代培养得到的减毒株（NC-a），该减毒株在小鼠体内引发了良好的免疫保护反应。鉴于人们更倾向于使用灭活疫苗而非活疫苗，本研究评估了NC-a减毒株（I. NC-a）在不同佐剂配合下的效果，实验对象为Balb/c小鼠。50只Balb/c小鼠被随机分为五组：G1组（I. NC-a加氢氧化铝佐剂）、G2组（I. NC-a加Montanide ISA 70佐剂）、G3组（I. NC-a不加佐剂）、G4组（活NC-a）和G5组（阴性对照组）。小鼠分别于两次间隔21天的时间接种2×10?个NC-a速殖子，随后再接种2.5×10?个毒力强的NC-1速殖子。研究内容包括生存率检测、评估体液和细胞免疫反应的血清学检测以及分子生物学分析。血清学结果显示，接种组与G5组之间存在显著差异（P<0.05），加佐剂的灭活疫苗组（G1和G2）与活疫苗组（G4）之间也存在显著差异。此外，G2组和G4组的存活率约为90%。总体而言，减毒灭活疫苗能够诱导出与活疫苗相当甚至更强的免疫保护作用。这些结果表明灭活疫苗具有潜力，进一步的研究有望开发出适用于多种宿主的、安全有效的新生孢子虫病疫苗，从而改变目前以活疫苗为主的研究方向。

引言

新生孢子虫（Neospora caninum）属于顶复门（Apicomplexa）下的细胞内寄生虫，是新生孢子虫病的致病因子（Dubey, 2003）。这种寄生虫在全球范围内广泛存在，可感染牛、羊、山羊、狗甚至鹿等动物（Dubey, 2005）。近几十年的研究表明，新生孢子虫会导致牛流产，造成巨大的经济损失，包括死亡动物的处理费用、犊牛的死亡、牲畜的重新繁殖成本以及牛奶产量的下降（Dubey et al., 2007; Dubey and Schares, 2011）。因此，新生孢子虫病是一个全球性的经济问题。

目前有多种方法用于控制这种感染，包括限制动物与狗粪便的接触以及淘汰受感染的动物（Reichel et al., 2014; Ortega-Mora, 2007）。然而，最有效的手段是疫苗，因为疫苗可以预防垂直传播和流产（Reichel and Ellis, 2009）。此前已有多种疫苗配方被测试，其中使用了活寄生虫、灭活寄生虫或减毒寄生虫。活寄生虫疫苗因其能够刺激细胞免疫和体液免疫而受到青睐（Miller et al., 2005; Williams et al., 2007）；但活寄生虫疫苗可能存在安全性问题且保质期较短，还可能引发慢性疾病并传染给胎儿（Rojo-Montejo et al., 2011）。因此，开发灭活疫苗更为安全，能有效预防动物感染。目前市场上唯一的牛用新生孢子虫病疫苗（NeoGard）也是灭活形式。基于这些研究结果，我们选择使用灭活疫苗平台来开发针对新生孢子虫的疫苗。

佐剂是能够增强机体对抗原非特异性免疫反应的化学或生物化合物。它们能提升针对病原体的特异性免疫反应，增强免疫保护效果，并通过增加抗原递送量发挥免疫调节作用（Wang et al., 2020）。佐剂应具备稳定性、安全性及易用性，因为它们可能影响动物的生长、繁殖能力和健康状况（Sun et al., 2018）。使用佐剂可减少抗原剂量，从而降低生产成本。因此，选择合适的佐剂是设计有效灭活疫苗的关键因素（Rojo-Montejo et al., 2011）。理想的疫苗配方应能激发平衡的免疫反应，并有助于揭示病原体的逃避机制（Pinheiro et al., 2018）。基于上述背景，本研究旨在评估通过体外长期传代培养得到的减毒株（NC-a）在灭活形式及不同佐剂（氢氧化铝和油乳剂）下的免疫保护效果。研究表明，在疫苗研发过程中，抗原和佐剂的选择至关重要，直接影响疫苗的有效性、安全性和免疫持续时间（Xing et al., 2025; Zhao et al., 2023; Facciolà et al., 2022）。值得注意的是，先前作为活疫苗使用的减毒株在小鼠、怀孕小鼠、胚胎卵和狗体内均表现出良好的非致病性和免疫原性（Amini et al., 2020; Khordadmehr et al., 2013; Olyaei et al., 2021）。本研究的结果为开发安全、稳定的灭活疫苗提供了重要参考。

实验方法

新生孢子虫（Neospora caninum）是一种属于顶复门的细胞内寄生虫，是新生孢子虫病的病原体（Dubey, 2003）。该寄生虫在全球范围内广泛存在，可感染多种动物。近几十年的研究表明，它会导致牛流产，造成严重的经济损失（Dubey et al., 2007, Dubey and Schares, 2011）。因此，研究新型疫苗具有重要意义。

本研究基于我们之前的研究（Amini et al., 2020），使用了Neospora caninum NC-a减毒株的速殖子。纯化的速殖子被接种到J774细胞系中。接种前，宿主细胞需先培养24小时。每天使用倒置显微镜进行相位对比观察，以检测速殖子的释放情况。当80–90%的宿主细胞被破坏并释放出大量速殖子时，表示培养成功。

血清学评估结果

如图1所示，根据ELISA检测结果，接种组的抗体反应明显强于对照组（P<0.05）。具体而言，双向ANOVA分析显示，实验第21天时G1组与G4组之间无显著差异（p=0.21），实验第42天时G2组与G4组之间也无显著差异（p=0.69）。

讨论

新生孢子虫病长期威胁着牛产业，造成了全球范围内的重大经济损失。目前尚无有效的药物或疫苗可用于预防和治疗该疾病。鉴于对新生孢子虫病控制的需求日益增加，尤其是对于拥有大规模养牛业的国家而言，研发安全有效的疫苗迫在眉睫（Monney and Hemphill, 2014）。

在我们之前的研究中，我们已经证明了活疫苗的有效性……（此处内容不完整，原文省略）

未引用的参考文献

(Bartley et al., 2009, Bartley et al., 2008, Chen et al., 2017, Inactivated, 2020, Mazuz et al., 2021, Morrison and Tomley, 2016, Pulendran, 2004, Romero et al., 2004, Zhang et al., 2010)

作者贡献声明

扎赫拉·卡巴赞（Zahra Khabazan）：方法学设计、数据管理。 萨洛梅赫·希拉利（Salomeh Shirali）：项目监督、资源调配、数据分析、概念构思。 扎赫拉·布托拉比（Zahra Bootorabi）：结果验证、软件应用、方法学设计、数据分析。 马汀·科斯罗普尔（Matin Khosropour）：初稿撰写、数据可视化、方法学研究、实验设计。 梅赫迪·纳马瓦里（Mehdi Namavari）：文本修订与编辑、项目协调、资金申请、概念构思。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本研究结果的财务利益冲突或个人关系。

致谢

我们感谢伊朗设拉子市的Razi疫苗与血清研究所及德黑兰伊斯兰自由大学科学研究院的支持与帮助，同时感谢扎赫拉·萨法里安博士（Dr. Zahra Saffarian）在研究过程中的协助。