《Research in Microbiology》：Molecular Characterization and Phylogenetic Analysis of Archived Bacillus anthracis Isolates from Karnataka, India.
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本研究成功复苏2018-2019年存档的8株炭疽芽孢杆菌，比较三种DNA提取方法，发现含氨苄青霉素的酚-氯仿法产DNA最高（3710 ng/μL）。PCR验证携带pXO1、pXO2毒力质粒及rpoB基因，系统发育分析显示质粒基因保守而rpoB染色体基因多样性显著，为印度卡纳塔克邦炭疽监测提供分子证据。
Manohar V. Raju | Shivaraj Murag | Ashwani Sharma | Kavya Shetty | N. Chandrashekara | Keerthana Ranganath | D.Rani Prameela | Yashas R. Kumar | Doddamane Rathnamma
动物饲养与兽医生物研究所（IAH&VB），班加罗尔 – 560 024
摘要
炭疽杆菌（Bacillus anthracis）是炭疽病的致病菌，在地方性流行地区始终构成威胁。在本研究中，成功复活了2018–2019年间保存的8株炭疽杆菌分离株，这表明其孢子具有很强的抵抗力，长期储存能够有效保持其致病性。基因组DNA的提取采用了三种方法：Qiagen DNeasy试剂盒、Zymo珠子法以及苯酚-氯仿提取法。在苯酚-氯仿提取法中加入氨苄西林后，通过选择性杀死营养细胞而减少了孢子的产生，从而提高了DNA的产量。该方法获得的DNA浓度最高达到3710 ng/μL。使用OIE推荐的引物进行PCR分析，确认了pXO1和pXO2致病性质粒以及染色体上的rpoB基因的存在。rpoB标记物因在亲缘关系密切的菌株间具有更高的分辨能力而被优先选择。系统发育分析显示质粒基因具有保守性，而rpoB基因则表现出显著多样性，表明这些分离株之间存在染色体变异。这些发现有助于印度卡纳塔克邦的炭疽病监测和分子流行病学研究，并强调了结合质粒和染色体标记物来理解菌株间差异的潜力。进一步的全基因组测序（WGS）将提供关于炭疽杆菌基因组多样性和进化动态的更深入见解。
引言
炭疽杆菌是一种能形成孢子的革兰氏阳性细菌，是全球主要的动物源性和生物威胁病原体。由于炭疽杆菌能够形成高度抗性的孢子，使其能够在环境中长期存活，因此炭疽病的爆发成为一个反复出现的挑战，尤其是在地方性流行地区[1]、[2]。在印度，多个邦存在炭疽病的动物流行情况，牲畜中的频繁爆发通过职业暴露和环境暴露对人类健康构成风险[3]、[4]、[5]、[6]。
在印度，无论是散发病例还是疫情都时有报道[7]，尤其是在卡纳塔克邦、安得拉邦、查谟和克什米尔邦、奥里萨邦以及泰米尔纳德邦[8]。1997年至2016年间，卡纳塔克邦共有206个村庄在不同时间检测到炭疽病[3]。根据我们实验室的记录，近年来炭疽病高发的地区包括Ballari、Koppal、Chikkaballapur、Chamarajanagar、Tumkur以及班加罗尔农村地区。
对炭疽杆菌的分子监测对于了解其流行病学特征、检测致病性菌株以及监测基因随时间的变化至关重要[9]。此类监测的一个关键方面是恢复和鉴定保存的分离株，这有助于回顾性评估菌株的多样性和进化趋势。尽管如此，很少有研究系统地评估长期保存的炭疽杆菌样本的活力和分子特性[10]、[11]、[12]。
本研究旨在通过恢复并分析2018–2019年间保存的8株炭疽杆菌分离株来填补这一空白。为了评估DNA的质量和产量，比较了三种不同的提取方法：Qiagen DNeasy试剂盒、Zymo珠子法以及传统的苯酚-氯仿法。随后通过OIE/WHO推荐的引物集[16]、[17]，针对质粒上的关键致病性决定因子（如pXO1（保护性抗原）和pXO2（荚膜）进行了分子鉴定[13]、[14]、[15]。此外，还扩增了染色体基因rpoB（RNA聚合酶β亚基）作为可靠的系统发育标记物，因为其在区分亲缘关系密切的菌株时具有更高的分辨能力[18]、[19]、[20]、[21]。通过这种方法，本研究揭示了保存的炭疽杆菌分离株的遗传稳定性，并评估了质粒和染色体标记物在菌株水平鉴别中的效用。
材料
材料
脑心浸液（Brain Heart Infusion, BHI）琼脂、多粘菌素B-溶菌酶（EDTA）PLET琼脂、5%羊血琼脂平板、蛋白酶、RNA酶-A和溶菌酶均购自印度马哈拉施特拉邦的HiMedia公司。苯酚：氯仿：异丙醇（25:24:1）混合物、醋酸钠、NaCl、EDTA、SDS、氯仿、氨苄西林钠盐和异丙醇均来自印度马哈拉施特拉邦的SRL Chemicals公司。乙醇来自VWR公司。用于PCR/热循环的Taq DNA聚合酶Master Mix含有1.5 mM的MgCl2，购自丹麦的Ampliqon公司。
保存样本的复活与初步鉴定
将保存的悬浮样本用无菌接种环接种到PLET琼脂和血琼脂平板上，然后在35 ± 2 °C下培养24小时。培养后，在脑心浸液（BHI）琼脂上观察到呈灰白色、外观类似玻璃的扁平菌落（图1（a）；在血琼脂上，菌落呈水母头状且不溶血（图1（b）），表明没有产生溶血素（溶血素通常会破坏红细胞）。
讨论
在本研究中，成功复活并鉴定了2018–2019年间保存的8株炭疽杆菌分离株，证明了长期储存不会影响病原体的活力或致病性。从长期保存的样本中恢复可存活菌株的能力表明了存档系统在流行病学研究中的实用性，并突显了炭疽杆菌孢子的强抵抗力。
这些分离株的基因组DNA通过三种方法提取
结论
从卡纳塔克邦保存的样本中成功复活并进行了基因组鉴定的炭疽杆菌分离株，证明了长期储存样本的稳定性和致病性的保持。对DNA提取方法的比较评估表明，氨苄西林预处理和适当的裂解条件显著影响了DNA的产量。关键致病基因和染色体标记物的分子确认，以及系统发育分析，进一步证实了这些特征的保守性
CRediT作者贡献声明
Yashas R Kumar：方法学研究、数据分析。
Kavya Shetty：方法学研究、数据分析、数据管理。
D Rathnamma：数据分析、数据管理。
N Chandrashekara：撰写、审稿与编辑、数据可视化、方法学研究、数据分析。
SHIVARAJ MURAG：撰写、审稿与编辑、项目监督、资金筹集、数据分析、概念构思。
Keerthana Ranganath：方法学研究、数据分析。
Manohar V Raju：撰写
利益冲突声明
作者声明不存在利益冲突。
致谢
作者声明所有炭疽杆菌培养均按照机构生物安全指南，在生物安全等级3（BSL-3）实验室中进行。
作者衷心感谢班加罗尔的动物健康与兽医生物研究所（IAH&VB）和南方区域疾病诊断实验室（SRDDL）/ KVAFSU在本研究期间提供的必要设施和支持。
