Kv1.3通道T1-S1连接区构象的早期决定因素：从新生肽折叠到四聚体组装的分子机制

本研究聚焦电压门控钾通道Kv1.3早期生物合成中T1-S1连接区的构象动态，通过半胱氨酸扫描与聚乙二醇化标记技术揭示其与膜脂及蛋白质的相互作用，并利用分子内交联证实S0区在核糖体出口后即形成α螺旋。研究进一步发现连接区长度与序列特异性调控T1域四聚化，且核心跨膜区T2域促进二聚体-二聚体组装。这些发现挑战了经典的"悬挂吊舱"模型，为Kv通道生物合成与功能调控提供了新机制见解。

　　

电压门控钾通道（Kv）在神经和免疫细胞中扮演着关键角色，其功能异常与多种疾病密切相关。然而，这些复杂蛋白质机器是如何在细胞中正确组装并发挥功能的？早期生物合成过程中的折叠事件如何影响通道的最终结构和功能？这些问题长期以来是领域内的研究难点。特别是连接胞质T1域和第一个跨膜段S1之间的T1-S1连接区，其构象动态与功能一直未被深入探索。传统观点认为该区域是一个完全暴露于水相的无序连接段，但这一假设缺乏实验证据。Kv1.3通道在T淋巴细胞活化与增殖中至关重要，其表达异常与慢性炎症性疾病、自身免疫 disorders、代谢紊乱甚至肿瘤行为相关，因此理解其生物合成机制具有重要生理和病理意义。

研究人员采用多种生物物理和生物化学方法，包括半胱氨酸扫描结合聚乙二醇化（pegylation）质量标记策略、分子内和分子间交联技术等。使用兔网织红细胞裂解液体外翻译系统，在微囊膜存在条件下合成蛋白质，通过³⁵S标记和蔗糖垫超速离心分离膜结合或核糖体结合肽段。关键技术包括：利用PEG-MAL（甲氧基-聚乙二醇-马来酰亚胺）进行可及性测定；使用o-PDM（邻苯二马来酰亚胺）进行分子内交联以探测S0区构象；通过工程化半胱氨酸对和缺失突变体研究T1-S1连接区在四聚化中的作用。

Determinants of accessibility/location of T1-S1 linker residues

通过半胱氨酸扫描和pegylation实验发现，在早期生物合成阶段，T1-S1连接区的大部分残基并非完全可及，而是处于受阻状态。S0序列和连接区C端残基的可及性最低（Fpeg 0.15-0.30），表明这些区域位于蛋白质-脂质和/或蛋白质-蛋白质界面。去污剂依赖性实验进一步揭示，N端连接残基（如153位）位于蛋白质-水界面，而S0区残基（如166和172位）同时存在蛋白质-蛋白质和蛋白质-脂质相互作用。这些发现与传统认为连接区完全水溶的"悬挂吊舱"模型相悖。

Conformation of S0 during biogenesis

利用分子内交联技术（Pxlink）发现，在核糖体出口隧道内S0处于延伸状态，但一旦 emergence from the ribosome exit tunnel，即在膜插入前的单体阶段就形成α螺旋。工程化半胱氨酸对165C/169C和168C/172C（相距一个螺旋 turn）的交联概率显著高于对照对165C/173C（相距两个螺旋 turn）。这一构象转变不依赖于膜的存在或T1四聚化，表明S0的螺旋形成是早期自主发生的生物物理过程。

Linker length-dependence for tetramerization

通过系统删除T1-S1连接区不同区段并分析四聚化效率，发现连接区不仅需要特定长度，更需要特定序列来促进T1域的正确折叠和组装。删除N端区域（如Δ153-181）显著降低多聚体形成和二聚体-二聚体组装效率。值得注意的是，仅保留12个天然连接残基就足以支持T1四聚化，表明连接区具有序列特异性的功能，而非简单的长度 spacer。

T2 domain promotes biogenic dimerization of T1 dimers

比较KpnI-cut（缺失大部分核心跨膜区）和EcoRI-cut（全长）构建体的四聚化效率，发现缺失核心区（ putative T2 domain）的片段虽然能形成二聚体，但二聚体-二聚体组装为四聚体的效率显著降低。这表明核心跨膜区存在一个 recognition domain（T2），促进T1二聚体进一步组装为四聚体，完善了Kv通道组装的传统认知。

本研究系统阐明了Kv1.3通道T1-S1连接区在早期生物合成中的构象动态和功能角色。研究发现挑战了沿用多年的"悬挂吊舱"模型，揭示连接区并非被动 spacer，而是通过特异的序列和构象（如S0区的早期螺旋形成）主动参与T1域的四聚化过程。特别重要的是，发现核心跨膜区存在一个新型识别域（T2），促进二聚体向四聚体的转化，这为理解Kv通道组装效率调控提供了新视角。这些发现不仅深化了对离子通道生物合成机制的理解，也为相关疾病（如自身免疫疾病、癌症）的治疗策略提供了潜在靶点——针对通道组装早期过程的干预可能成为 new therapeutic avenue。该研究发表于《Journal of Molecular Biology》，展现了多学科方法在膜蛋白折叠研究中的强大威力。