甜菜高效遗传转化及愈伤组织再生体系的优化及其在抗病育种中的应用

《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》：Development of an improved Agrobacterium-mediated transformation and callus-based regeneration system for sugarbeet (Beta vulgaris L.)

本研究针对甜菜（Beta vulgaris L.）遗传转化和再生困难的问题，通过优化下胚轴外植体的愈伤组织诱导、农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）介导的转化以及植株再生条件，建立了一套高效、可重复的转化和基于愈伤组织的再生体系。该体系显著提高了转化效率，再生植株经分子验证证实了转基因（RUBY）的稳定整合与表达，为利用RNA干扰（RNAi）和基因编辑技术靶向甜菜重要病原体（尤其是病毒）提供了关键技术支撑，对甜菜抗病育种具有重要意义。

　　

作为一种全球重要的糖料作物，甜菜（Beta vulgaris L.）为世界提供了超过35%的蔗糖。然而，这种作物极易受到病毒、细菌和真菌引起的多种病害侵袭，严重威胁其产量和品质。传统的甜菜育种因其高度杂合性、二年生生殖周期以及复杂的遗传背景而进展缓慢。生物技术手段，特别是遗传转化，为快速引入优良性状提供了可能。但甜菜的组织培养和再生困难、基因型依赖性强以及基因组复杂等特点，使其遗传转化一直是个挑战。尽管农杆菌介导的转化法因其简单、高效而被广泛应用，但此前甜菜的转化研究多局限于直接器官发生（不经过愈伤组织阶段），这可能导致嵌合体比例高、转基因整合不一致。因此，开发一套基于愈伤组织的、高效的农杆菌介导转化和再生系统，对于获得非嵌合、转基因稳定整合的甜菜株系，进而有效评估RNA干扰（RNAi）和基因编辑等先进技术至关重要。

为开展此项研究，研究人员主要应用了以下几项关键技术：首先，优化了甜菜种子灭菌和萌发条件，并使用下胚轴作为外植体来源。其次，建立了高效的农杆菌介导转化流程，包括农杆菌菌液浓度（OD₆₀₀0.4-0.5）、侵染时间、共培养时间等关键参数的优化，并利用视觉报告基因RUBY进行转化效率评估。第三，系统优化了从愈伤组织诱导（Callus Induction Medium, CIM）、芽再生（Shoot Induction Medium, SIM-I 至 SIM-IV）到根诱导（Root Induction Medium, RIM-I 至 RIM-III）的一系列组织培养基激素配比，特别是逐步提高了N⁶-苄基氨基嘌呤（BAP）、激动素（Kinetin）和α-萘乙酸（NAA）的浓度。最后，通过聚合酶链式反应（PCR）、逆转录PCR（RT-PCR）以及随机扩增多态性DNA（RAPD）分析等分子生物学技术对转基因植株进行了验证和遗传稳定性评估。

结果

优化用于选择甜菜转化外植体的卡那霉素浓度

研究人员首先确定了能够有效抑制未转化外植体组织生长的卡那霉素（Kanamycin）最佳选择浓度。实验表明，当愈伤组织诱导培养基（CIM）中含有50 mg l^-1或更高浓度的卡那霉素时，没有外植体能够存活。因此，后续转化实验中选择50 mg l^-1的卡那霉素进行筛选。同时，植物保护混合物（PPM）敏感性测试表明，0.1%的PPM浓度能在控制污染和维持外植体活力之间取得最佳平衡。

-1,（ii）25 mg l^-1,（iii）50 mg l^-1,（iv）75 mg l^-1,（v）100 mg l^-1,（vi）125 mg l^-1,（vii）150 mg l^-1,（viii）175 mg l^-1和（ix）200 mg l^-1，拍摄于第0天。（C）在CIM上培养3周后，卡那霉素对甜菜下胚轴外植体存活的影响'>

建立甜菜的体外再生体系

研究建立了一套有效且可重复的甜菜体外再生系统。以下胚轴作为外植体，在黑暗条件下培养于CIM上，21天后可观察到愈伤组织形成。将愈伤组织转移到含有不同浓度BAP、激动素和NAA的芽诱导培养基（SIM-III和SIM-IV）上，能够在35天左右诱导出芽，并在SIM-IV上21天后实现多重芽的再生，芽再生率可达36%。

优化农杆菌介导的甜菜遗传转化

研究优化了农杆菌介导转化甜菜的各项参数。使用含有视觉报告基因RUBY的pCBL101-RUBY载体。结果表明，农杆菌菌液浓度（OD₆₀₀0.4-0.5）、侵染15分钟、共培养2天以及在黑暗中进行愈伤组织诱导是最佳条件。子叶外植体在共培养2天后可观察到32.9%的瞬时RUBY表达。下胚轴外植体在相同条件下也能有效转化并形成愈伤组织，但红色表型不可见。经过连续筛选，子叶和下胚轴来源的愈伤组织对卡那霉素的抗性率分别为24.8%和13.4%。

甜菜转化愈伤组织的再生

将卡那霉素抗性愈伤组织转移到四种不同的芽诱导培养基（SIM）上。研究发现，下胚轴来源的愈伤组织在SIM-II和SIM-III上培养3-4周后开始形成芽，并在SIM-IV上以36%的效率再生出多重芽。而子叶来源的愈伤组织未能诱导出芽。再生芽在含有较高浓度NAA和吲哚-3-丁酸（IBA）（均为3.0 mg l^-1）的RIM-III上，两周内即可诱导生根。提高SIM中的BAP和激动素浓度以及RIM中的NAA和IBA浓度，加速了芽形成和根诱导的进程。所有生根植株经驯化后均能在土壤中存活，且生长正常。

转基因植株的分子分析

对再生植株进行分子验证。PCR扩增显示，11株甜菜植株中均能检测到RUBY基因（400 bp），而对照非转基因植株中则无。对PCR产物的测序分析表明，其与引入的RUBY序列具有97-100%的核苷酸一致性，证实了转基因的成功整合。RT-PCR分析进一步在所有11株转基因株系中检测到了RUBY基因的转录本，表明转基因成功表达。

RAPD分析

为了评估转化植株中可能出现的体细胞克隆变异，研究人员使用RAPD引物A05对8个独立的转基因株系和4个非转基因植株进行了分析。结果显示，所有再生转基因株系与非转基因植株的DNA条带模式一致，未检测到多态性，表明体外再生过程保持了高度的遗传稳定性。

结论与讨论

本研究成功建立并优化了一套高效、可重复的农杆菌介导的甜菜遗传转化及基于愈伤组织的再生体系。该体系的关键创新点在于系统优化了从外植体选择、农杆菌侵染条件、愈伤组织诱导、芽和根再生到植株驯化的全过程。与以往侧重于直接器官发生（不经过愈伤组织）的转化方法相比，本研究建立的基于愈伤组织的间接再生途径有望产生更少嵌合体和体细胞克隆变异，从而获得转基因均匀整合的株系。研究证实，通过优化激素配比（如逐步提高BAP、激动素、NAA和IBA的浓度），可以显著提高芽再生率和加速根的形成。分子分析（PCR、测序、RT-PCR）确证了转基因（RUBY）在再生植株中的稳定整合和表达，而RAPD分析则证明了再生植株具有良好的遗传稳定性。

尽管RUBY报告基因在部分愈伤组织阶段可见表达，但在再生植株中未观察到红色表型，推测可能与甜菜特有的基因沉默机制或其他尚未明确的分子机制有关，但这并不影响转基因整合和转录的确认。本研究开发的转化和再生 protocols（方案）大大缩短了获得转基因甜菜植株的时间，为后续利用RNAi和基因编辑技术靶向甜菜重要病原体（尤其是病毒）进行功能基因研究和抗病育种奠定了坚实的技术基础。这套技术方案对于克服甜菜遗传转化的瓶颈，推动其分子育种进程具有重要的意义。该研究成果发表于《Plant Cell, Tissue and Organ Culture (PCTOC)》期刊。