利用细菌来源的抗生素筛选基因在绿藻浒苔中实现稳定转基因表达及CRISPR介导的敲入系统

为解决大型绿藻浒苔缺乏高效稳定转化系统的问题，研究人员开发了基于细菌抗生素抗性基因aph7"的模块化质粒，利用内源pUpRbcS启动子驱动表达，实现了外源基因的稳定遗传和表达，并成功建立CRISPR/Cas9介导的敲入系统，为浒苔功能基因组研究和生物技术应用提供了重要工具平台。

　　

大型海藻作为重要的海洋生物资源，在生态和经济领域都具有不可替代的价值。其中，绿藻门石莼属的浒苔（Ulva prolifera）因其生长迅速、分布广泛的特点，已成为基础研究和应用开发的热点模式生物。然而，与陆生植物相比，大型海藻的分子生物学研究相对滞后，特别是缺乏高效的遗传转化工具，严重制约了对其生物学特性的深入探索和生物技术应用开发。

传统的遗传转化技术依赖于选择标记基因来筛选成功整合外源DNA的细胞。虽然内源毒素基选择标记（如腺嘌呤磷酸核糖转移酶APT和肽基脯氨酰异构酶FKB12）已在海藻中得到应用，但这些标记存在编辑效率低、可能共靶向其他基因等问题。此外，基于表型变化的选择标记（如植物烯去饱和酶PDS和MYB转录因子）虽然在高等植物中常用，但在海藻中尚未见成功报道。这些技术瓶颈限制了浒苔等经济海藻的基因功能研究和遗传改良。

为了突破这些限制，Qin等研究人员在《BMC Plant Biology》发表了创新性研究成果，成功建立了浒苔的稳定转基因表达系统和CRISPR介导的基因敲入技术。他们开发了一套基于细菌抗生素抗性基因的分子工具，为浒苔的遗传操作提供了新的解决方案。

研究人员采用了几项关键技术方法：利用实验室培养的浒苔E21株系（源自日本高知县 Shimato River）作为实验材料；构建了包含内源pUpRbcS启动子和aph7"基因的模块化质粒pRa7"；比较了PEG和PEG-Ca²⁺两种转化方法的效率；通过CRISPR/Cas9核糖核蛋白复合体（RNP）实现基因敲入；采用嵌套PCR和测序验证突变体。

Growth Inhibition assay under different concentrations

研究人员首先确定了hygromycin B（HygB）对浒苔生长的抑制浓度。经过30天的培养实验，发现8 mg/mL的HygB能够显著抑制藻体生长，而10 mg/mL则导致完全致死，因此选择这两个浓度进行后续转化子筛选。

Characterization of endogenous pUpRbcS

通过对UpRbcS基因启动子区域的分析，研究人员扩增了起始密码子上游978 bp的启动子序列。生物信息学分析预测了该启动子区域的顺式作用元件和TATA盒，其中假定的转录起始位点（TSS）位于起始密码子上游650 bp处，TATA盒位于TSS上游29-25 bp处。这些关键元件的确定为后续载体构建提供了重要依据。

Transgene expression with endogenous promoters

研究人员构建了pRa7"质粒，包含pUpRbcS启动子、aph7"基因和来自莱茵衣藻的CrRbcS2终止子。通过比较两种转化缓冲液（UTB1和UTB2）的转化效率，发现含有60% PEG 4000的UTB1缓冲液获得了0.141%的转化效率，显著高于UTB2的0.017%。

Analysis of the bacterial aph7 gene transcription

基因组PCR和cDNA-PCR分析证实，aph7"基因成功整合到转化子基因组中并实现稳定表达。四个转化子都检测到了预期的aph7"片段，而野生型对照中则没有扩增产物。更重要的是，该外源基因能够在T1代中稳定遗传，并在HygB选择压力下正常繁殖。

Phenotype of CRISPR-mediated HygR cassette knock-in mutants

研究人员进一步开发了CRISPR介导的敲入系统，将HygR盒插入到内源选择基因UpAPT位点。获得的敲入突变体能够同时抵抗2-氟腺嘌呤（2-FA）和HygB的双重选择压力，表现出明显的抗性表型。

Nested PCR screening and CRISPR-based knock-in confirmation at UpAPT locus

通过嵌套PCR方法，研究人员证实了HygR盒成功整合到UpAPT位点。野生型的扩增片段为862 bp，而10个突变体显示了约3000 bp的片段，表明CRISPR敲入的HygR盒已成功整合。

Validation of KI mutants by sequencing and cDNA-PCR

测序分析显示，KI-1和KI-2突变体在敲入靶位点存在碱基缺失，可能导致UpAPT翻译时的移码突变。虽然这些突变体的HygR盒启动子区域存在部分缺失，但aph7"的转录仍然正常进行，表明pUpRbcS的核心启动子区域足以驱动外源基因的表达。

这项研究的结论表明，利用细菌来源的aph7"基因作为选择标记，结合内源pUpRbcS启动子，能够在浒苔中实现稳定高效的转基因表达。优化的PEG转化方法显著提高了转化效率，而CRISPR/Cas9介导的基因敲入系统为精确的基因组编辑提供了有力工具。

该研究的重大意义在于首次在浒苔中建立了基于抗生素选择标记的稳定转化系统，突破了传统内源选择标记的限制。这套分子工具不仅为浒苔的基因功能研究提供了技术支持，也为大型海藻的遗传改良和生物技术应用开辟了新的途径。通过精确的基因组编辑，未来可以实现对浒苔重要农艺性状的改良、代谢途径的优化以及有价值化合物的生物合成，推动海藻资源在食品、饲料、医药和能源领域的综合利用。

这项研究成果标志着大型绿藻分子生物学研究进入了一个新阶段，为浒苔乃至其他经济海藻的精准育种和合成生物学应用奠定了坚实基础，对促进海洋生物资源的可持续利用具有重要战略意义。