黑曲霉共表达锰过氧化物酶与漆酶杂合体Lac131强化木质素生物转化的优化策略

本研究针对木质素生物转化效率低的难题，通过基因工程手段在工业丝状真菌黑曲霉中优化表达了Phanerochaete chrysosporium来源的锰过氧化物酶(mnP)和Trametes sp. C30来源的漆酶杂合体Lac131。研究发现，采用完整基因组编码序列(gmnp2)、添加牛血红蛋白(bHg)或大豆蛋白(soyPs)、并敲除蛋白酶转录调控因子prtT和囊泡运输负调控因子vsm1，可显著提高mnP产量(活性达575 U/L)；Lac131活性达3895 U/L，较前人研究提高4-7倍。两种酶可有效降解酚类染料和模型木质素二聚体，为木质素高效生物炼制提供了新策略。

　　

木质素作为植物细胞壁中含量仅次于纤维素的天然高分子聚合物，其复杂的芳香族结构和顽固的抗降解特性一直是生物燃料生产的瓶颈。自然界中白腐真菌虽能分泌木质素降解酶，但天然菌株产酶效率低、培养周期长，且酶系复杂难以调控。更棘手的是，木质素降解过程中产生的活性自由基易导致产物再聚合，反而降低转化效率。如何突破酶生产瓶颈，实现木质素高效、定向转化，成为生物炼制领域的关键挑战。

工业明星菌株黑曲霉(Aspergillus niger)以其强大的蛋白分泌能力和遗传操作潜力进入研究者视野。尽管它本身不产木质素降解酶，但能否通过基因工程改造，使其成为高效生产锰过氧化物酶(manganese peroxidase, mnP)和漆酶(laccase, Lac)的细胞工厂？这项发表于《Biotechnology for Biofuels and Bioproducts》的研究给出了肯定答案。

研究团队采用多技术联用策略：通过化学介导的原生质体转化将锰过氧化物酶基因(mnp1-mnp5)和漆酶杂合体基因(lac131)导入黑曲霉；利用CRISPR-Cas9技术敲除蛋白酶调控基因prtT和囊泡运输基因vsm1；通过纳米结构引发质谱(NIMS)技术实时监测酶对模型木质素二聚体的切割效率；采用96孔板高通量酶活检测体系优化培养条件。

Optimal production of Phanerochaete chrysosporium manganese peroxidases and Trametes sp. C30 laccase hybrid Lac131 in Aspergillus niger

研究发现来自白腐真菌Phanerochaete chrysosporium的5种锰过氧化物酶同工酶中，mnp2的完整基因组编码序列(gmnp2)在黑曲霉中表达效果最佳。当培养基中添加5 g/L牛血红蛋白(bHg)时，酶活达到243 U/L(36小时)，显著优于血红素补充组。培养条件优化实验表明：25℃、200 rpm、初始pH4.5最适合mnP生产。意外发现大豆蛋白(soyPs)和脱脂乳蛋白(skimMPs)可替代昂贵bHg，使酶活提升至636 U/L，而牛血清 albumin(BSA)效果不佳。

Improvement of overall mnP production via reduction of protease degradation and protein secretory pathway amendment

蛋白酶基因prtT的敲除使mnP产量提升5倍，进一步敲除v-SNARE结合蛋白基因vsm1后，酶活达到575 U/L。证明调控分泌途径和抑制蛋白酶降解是提高异源蛋白产量的关键策略。

Transgene expression of laccase hybrid(Lac131) of Trametes sp. C30 in transgenic A. niger

Trametes sp. C30来源的漆酶杂合体Lac131在黑曲霉中实现超高表达，在prtT△背景菌株中活性达3895 U/L，比前人报道提高4-7倍。值得注意的是，bHg对该酶 production同样有促进作用，暗示其可能具有普适性的蛋白稳定作用。

Evaluation of mnP and laccase hybrid decolorization of selected aromatic dyes

功能实验显示mnP对溴酚蓝和结晶紫的脱色率分别达92%和80%，显著优于漆酶。漆酶杂合体对甲基橙和亮蓝的脱色效果较好(28.3%和22.3%)，但对Remazol亮蓝R无效，表明两种酶具有互补的底物特异性。

Activity of mnP and laccase hybrid with NIMS-tagged lignin dimers

NIMS质谱成像技术证实：mnP在低浓度(5 U/L)下1小时内即可切割90%的β-O-4'木质素二聚体；对β-β'二聚体的切割更迅速，10分钟内完全降解。漆酶需更高浓度(50-200 U/L)才能达到相当效果，证明mnP在木质素解聚中更具优势。

该研究通过多维度优化策略，成功将黑曲霉改造为高效木质素降解酶生产平台。其中四个技术突破尤为关键：首次发现大豆蛋白可替代昂贵血红蛋白作为酶稳定剂；证实蛋白酶调控网络改造对异源蛋白表达的倍增效应；实现漆酶杂合体在丝状真菌中的最高表达水平；利用NIMS技术实时解析酶对特定木质素键型的切割效率。这些成果不仅为木质素生物炼制提供了新酶源，更开创了多酶协同生物转化新范式。未来通过CRISPR多重编辑技术将多种mnP同工酶共表达于同一宿主，有望实现与天然白腐真菌相当的酶生产水平，且培养时间从天然菌株的数天缩短至36小时，真正实现木质素 valorization的工业化应用。