在生物工程复合支架上，优化种子细胞密度以促进脂肪源性干细胞分化为类上皮细胞

《Disease-a-Month》：Optimization of seeding cell density for differentiation of adipose-derived stem cells into epithelial-like cells on bioengineered composite scaffolds

本研究探讨脂肪源性干细胞（ASC）上皮分化的生物学因素，通过构建含聚乙烯多孔支架和纤维蛋白密封剂的复合结构，在 submerged 和 air-liquid interface (ALI)条件下培养不同密度的ASC，发现5×10^6/cm2时上皮分化最显著，长期ALI培养导致分化标志物下降，但共培养宿主上皮细胞可维持表达，需优化设计以促进ciliogenesis|

　　这项研究探讨了影响脂肪来源干细胞（Adipose-Derived Stem Cells, ASC）上皮分化的关键生物因素，旨在开发一种工程化的上呼吸道组织构建体。研究中，研究人员将一部分ASC种植在含有另一部分ASC的多孔聚乙烯支架（Medpor?）中，并使用纤维蛋白密封剂（Tisseel）作为基质。这种设计结合了多孔聚乙烯支架的结构支撑性和纤维蛋白密封剂的生物活性，从而为细胞提供一个更接近体内微环境的培养平台。通过调整ASC的种植密度，研究人员希望找到一种既能促进上皮分化，又能维持细胞活性和功能的最佳方案。

研究团队首先在水下培养条件下对不同ASC种植密度的构建体进行了11天的培养，以实现部分上皮分化（Partial Epithelial Differentiation, PD）。这些密度包括5×10^5、1×10^6、2.5×10^6和5×10^6细胞每平方厘米。随后，他们将部分构建体转移至气液界面（Air-Liquid Interface, ALI）条件中，进一步培养了10天或21天，分别称为PD/ALI-21d和PD/ALI-32d。为了模拟移植后与宿主上皮细胞的相互作用，部分PD/ALI-32d构建体还与支气管上皮细胞（BEAS）共培养。通过检测多种上皮基底细胞、分泌细胞和纤毛细胞的基因表达，并结合免疫组织化学分析，研究人员评估了ASC在不同条件下的分化程度。

研究结果表明，ASC在5×10^6细胞每平方厘米的种植密度下表现出最高的部分上皮分化能力。这说明该密度可能是实现上皮分化的一种有效策略。在PD/ALI-21d条件下，基底细胞和分泌细胞的基因表达显著上升，而纤毛细胞的基因表达则没有明显变化。这表明，在较短时间的气液界面培养中，ASC主要朝向基底和分泌细胞方向分化，但未能达到纤毛细胞的分化水平。然而，在PD/ALI-32d条件下，基底细胞和杯状细胞的基因表达水平下降，部分间质干细胞的标志物也有所减少。这提示，在长期的气液界面培养过程中，如果没有与宿主上皮细胞的共培养，ASC可能无法维持其上皮分化状态，特别是对于分泌型细胞的分化。

为了验证这一假设，研究人员将PD/ALI-32d构建体与BEAS共培养，结果发现这种共培养方式能够维持基底细胞和杯状细胞的基因表达水平，同时可能有助于ASC进一步分化为功能性上皮细胞。这表明，与宿主上皮细胞的直接接触对于ASC的最终分化至关重要，尤其是在气液界面条件下。这些发现对于理解ASC在体外培养过程中的分化潜力具有重要意义，并为未来的组织工程研究提供了新的思路。

上呼吸道的重建在临床上是一个重要的需求，特别是在需要切除部分气道的癌症、创伤或疾病患者中。生物工程化的气道构建体不仅需要具备良好的机械强度，还必须能够有效促进上皮化，以防止感染并维持气道的正常功能。气道上皮由多种细胞类型组成，包括纤毛细胞、杯状细胞和基底细胞，这些细胞在维持气道防御功能和黏液分泌中发挥关键作用。传统的组织工程方法通常依赖于将细胞直接种植在支架上，但这种方法可能无法完全模拟体内复杂的微环境，导致细胞分化不充分或功能不完善。

为了克服这一挑战，研究人员选择使用多孔聚乙烯支架作为主要的结构支撑材料。这种材料具有良好的生物相容性和机械稳定性，能够提供一个长期的结构框架。然而，多孔聚乙烯本身具有一定的疏水性，这可能会影响细胞的附着和生长。因此，研究人员引入了纤维蛋白密封剂作为第二组分，以增强细胞的附着能力并促进组织的生长。纤维蛋白密封剂是由纤维蛋白原、凝血酶、因子 XIII、氯化钙和抗纤溶酶等成分组成的，当它们混合后会形成一种凝胶状的基质。这种基质不仅能够提供一个三维的细胞培养环境，还能通过释放生物活性因子促进细胞的分化和增殖。

此外，脂肪来源干细胞因其具有多向分化潜能而被认为是组织工程的理想细胞来源之一。它们不仅可以分化为上皮细胞，还能分化为脂肪、肌肉和骨等多种细胞类型。这使得ASC在组织修复和再生领域具有广泛的应用前景。然而，目前关于ASC在纤维蛋白密封剂上的分化潜力的研究仍然有限。因此，本研究不仅关注ASC在不同密度下的分化情况，还探讨了在气液界面条件下，是否可以通过与宿主上皮细胞的相互作用，进一步促进ASC的分化。

研究团队的实验设计基于这样一个假设：在气液界面条件下，ASC可能会经历进一步的分化，尤其是在与宿主上皮细胞接触后。为了验证这一假设，研究人员在气液界面培养条件下对PD构建体进行了更长时间的培养，并观察了细胞的分化情况。结果显示，即使在较长的培养时间下，ASC的分化仍然受到限制，特别是对于纤毛细胞的分化。这表明，单纯的气液界面培养可能不足以诱导ASC完全分化为功能性上皮细胞，尤其是在缺乏宿主细胞相互作用的情况下。

为了进一步探究这一现象，研究人员还评估了ASC在不同培养条件下的基因表达情况。他们选择了多种标志基因，包括与间质干细胞相关的基因、基底细胞相关的基因、分泌细胞相关的基因以及纤毛细胞相关的基因。通过比较这些基因在不同条件下的表达水平，研究人员能够更全面地了解ASC在体外培养过程中的分化动态。此外，免疫组织化学分析则为这些基因表达提供了空间上的验证，使得研究结果更具说服力。

在讨论部分，研究团队回顾了以往的气道组织工程研究，并指出大多数研究中使用的构建体主要依赖于间质干细胞或上皮细胞的种植。然而，这些方法可能无法完全模拟体内复杂的细胞相互作用，从而影响最终的组织功能。相比之下，本研究提出了一种新的策略，即利用ASC在构建体表面的种植来诱导上皮分化。这种方法不仅能够促进构建体的上皮化，还能利用ASC的多向分化能力，使其在体内移植后能够更好地适应宿主环境。

研究团队还指出，ASC在气液界面条件下的分化可能受到多种因素的影响，包括细胞密度、培养时间以及与宿主细胞的相互作用。因此，为了提高ASC在体外培养过程中的分化效率，需要进一步优化这些条件。例如，可以尝试不同的细胞密度组合，或者探索更长时间的气液界面培养是否能够诱导ASC分化为更多的上皮细胞类型。此外，研究团队还提到，为了确保ASC能够有效地分化为特定的上皮细胞类型，如纤毛细胞，可能需要在培养过程中引入特定的生长因子或信号分子。

总体而言，这项研究为气道组织工程提供了一种新的思路，即通过结合多孔聚乙烯支架和纤维蛋白密封剂，利用ASC的分化潜力来促进构建体的上皮化。研究结果表明，ASC在5×10^6细胞每平方厘米的种植密度下能够实现最佳的部分上皮分化，但为了进一步诱导其分化为特定的上皮细胞类型，特别是纤毛细胞，可能需要与宿主上皮细胞共培养。此外，研究还强调了细胞密度和培养条件在ASC分化过程中的重要性，为未来的组织工程研究提供了重要的参考依据。

在实际应用中，这种工程化的上呼吸道构建体可能具有广泛的临床意义。例如，它可以用于修复因肿瘤切除、创伤或先天性缺陷而导致的气道损伤。通过将ASC种植在支架上，并结合纤维蛋白密封剂，研究人员能够创造出一个更加接近体内微环境的构建体，从而提高其在体内的存活率和功能表现。此外，这种构建体还可以根据患者的个体差异进行定制，以更好地适应其气道的形状和大小。

然而，这项研究也存在一些局限性。首先，虽然研究团队在体外条件下成功诱导了ASC的部分上皮分化，但这些结果是否能够完全复制到体内环境仍有待验证。其次，长期的气液界面培养可能会影响细胞的存活率和功能，因此需要进一步研究如何在不损害细胞活性的情况下实现更充分的分化。此外，研究团队在实验中使用的是来自健康供体的ASC，而实际临床应用中可能需要使用患者自身的细胞，这可能会引入一些额外的变量，如细胞来源的差异和免疫排斥反应等。

尽管存在这些挑战，研究团队仍然认为，他们的研究为未来的气道组织工程提供了重要的基础。通过优化ASC的种植密度和培养条件，研究人员能够更有效地诱导其分化为上皮细胞，从而提高构建体的功能性。此外，研究还强调了与宿主细胞的相互作用在促进ASC分化中的关键作用，这为未来的临床应用提供了新的方向。例如，可以考虑在构建体中引入更多的宿主细胞，以增强其与体内环境的适应性。

在总结部分，研究团队指出，虽然他们的研究发现了一些关键的分化条件，但仍需进一步探索如何在体内条件下实现更有效的上皮化。他们还提到，为了提高ASC的分化效率，可能需要对研究设计进行一些调整，例如引入更多的生长因子或优化培养条件。此外，研究团队还强调了在实际应用中需要考虑的伦理和安全性问题，特别是使用患者自身细胞时可能面临的挑战。

总的来说，这项研究不仅为气道组织工程提供了一种新的方法，还揭示了ASC在体外培养过程中的分化潜力和限制。通过结合多孔聚乙烯支架和纤维蛋白密封剂，并调整ASC的种植密度和培养条件，研究人员能够更有效地促进构建体的上皮化。这些发现为未来的组织工程研究和临床应用提供了重要的理论依据和实践指导。