综述：驯化与未驯化人类微生物的工程策略

本综述系统评述了人类微生物组工程化策略的最新进展，重点探讨了如何利用基因编辑工具（如CRISPR-Cas）和新型递送系统（如CRAGE、ACE）突破传统驯化菌株（如EcN、LAB）和未驯化菌株（如皮肤共生菌、梭菌）的遗传操作瓶颈，为开发精准 microbiome therapeutics 提供关键技术路径。

　　

工程化人类微生物的策略：从驯化菌株到未驯化菌株

引言

人类微生物组是一个由细菌、病毒、真菌和古菌组成的动态生态系统，广泛分布于人体各部位，显著影响健康与疾病状态。这些微生物群落参与营养吸收、免疫调节和神经发育等关键生理过程，而菌群失调则与炎症性肠病、肥胖、糖尿病、神经系统疾病和癌症等多种疾病密切相关。尽管粪菌移植（FMT）和传统益生菌（如乳杆菌和双歧杆菌）已用于微生物组调节，但其效果常因宿主-微生物相互作用的复杂性而难以预测。近年来，基因组测序和合成生物学的进步推动了微生物工程化的发展，使精准操控驯化和未驯化微生物成为可能，为开发可控、可预测的微生物组疗法开辟了新道路。

驯化人类微生物的工程化治疗应用

某些人类共生微生物经过长期驯化，其遗传特性已被精细调控，可用于递送治疗载荷、调节宿主免疫和检测疾病信号。大肠杆菌Nissle 1917（EcN）和乳酸菌（LAB）是两类代表性驯化菌株，具有稳定的生长特性、注释清晰的基因组和易于遗传操作的优势。

EcN通过转化和接合方法被广泛工程化，应用于癌症免疫治疗、肠道代谢调节、抗菌策略、生物传感和靶向治疗递送。质粒系统和基因组整合系统均成功用于EcN：前者通过可变拷贝数和调控元件实现表达调控，例如用于表达检查点阻断纳米抗体和小分子水杨酸；后者则通过CRIM方法在?80位点插入同步裂解电路（SLIC），或利用CRAGE系统稳定整合荧光/生物发光报告基因和生物合成基因簇。接合方法进一步扩展了EcN的工程能力，例如利用T0SS系统通过外膜囊泡局部递送多种酶。

乳酸菌中的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）因遗传操作便利而成为重要底盘，被工程化用于生产小分子（如抗氧化剂番茄红素和神经递质GABA）及复杂蛋白（如G-CSF和GLP-1激素）。尽管进展显著，当前工程化努力仍集中于少数可培养菌株，未能覆盖微生物组的功能多样性。开发普适性遗传工具以挖掘未开发多样性，将是解锁下一代微生物组疗法的关键。

未驯化人类微生物的工程化治疗应用

绝大多数人类微生物组成员因DNA摄取效率低、防御系统强和专用工具缺乏而难以遗传操作。近期进展通过改良接合和转化策略，结合CRISPR-Cas、同源重组和等位基因交换等工具，实现了这些微生物中治疗基因的稳定表达。

皮肤细菌的优化转化

表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）和痤疮丙酸杆菌（Cutibacterium acnes）是皮肤优势共生菌，但其遗传操作长期受限于菌株特异性限制系统和低效DNA摄取。针对前者，研究人员通过质粒在E. coliDC10B（Δdcm）中传代以规避宿主限制系统，结合山梨醇/甘油洗涤和电穿孔优化，成功在13/17株菌中实现遗传修饰；针对后者，通过优化电穿孔缓冲液、质粒甲基化模拟和细胞壁削弱策略，建立了高效转化流程。工程化皮肤共生菌已用于诱导肿瘤特异性T细胞反应、增强黏膜免疫、调节皮肤挥发物以减少蚊虫吸引、分泌治疗蛋白调节皮脂分泌和保护角质细胞免受UV氧化应激。

梭菌的基因组工程策略

梭菌（Clostridium）作为革兰阳性严格厌氧菌，因其在缺氧肿瘤区域选择性萌发和增殖而被用作肿瘤靶向载体。尽管质粒转化和接合方法已建立，但质粒不稳定性促使基因组工程成为首选策略。

等位基因耦合交换（ACE）通过双交换同源重组实现精确、无痕染色体整合，通常靶向pyrE位点以利用尿嘧啶营养缺陷型和5-氟乳清酸抗性进行反选择。该方法已用于工程化非致病性产孢梭菌表达脑膜炎奈瑟菌I型硝基还原酶（NmeNTR），用于梭菌导向的酶前药治疗（CDEPT），并整合双转录报告系统到艰难梭菌中可视化毒素和孢子形成基因表达。

ClosTron系统利用乳酸乳球菌的移动组II内含子进行靶向基因破坏和插入，通过碱基配对和内含子编码蛋白（IEP）指导精确遗传插入，已成功应用于多种梭菌菌株。近期通过耦合内源木糖诱导启动子（Pxyl）和尿嘧啶磷酸核糖基转移酶（Upp）反选择系统提高了其效率。

CRISPR-Cas系统彻底改变了梭菌基因组编辑。尽管经典CRISPR-Cas9已用于艰难梭菌，但其应用受Cas9毒性、低转化效率和脱靶效应限制。Cas12a（Cpf1）因毒性较低、兼容AT丰富基因组和T丰富PAM识别以及固有RNase活性支持多重编辑而成为有前景的替代工具。四环素或木糖诱导型CRISPR-Cas12a系统的开发进一步降低了细胞负担，实现了高效编辑和近红外成像蛋白IFP2.0的表达。

通过噬菌体介导转导和CRAGE方法工程化未驯化大肠杆菌

肠道原生菌株EcAZ-1能稳定定植肠道超过六个月且不扰动原生微生物组，但因转化抗性难以操作。利用P1vir噬菌体转导从MG1655衍生的裂解物引入胆汁盐水解酶bsh和gfp基因，以及通过CRAGE直接整合柚皮素和类菌孢素氨基酸生物合成基因簇，成功实现了其工程化。CRAGE已应用于约60种非模型菌株（主要来自变形菌门和放线菌门），展示了其在扩展合成生物学到人类相关微生物中的潜力。

展望

微生物组工程在治疗递送、免疫调节和疾病预防方面潜力巨大。尽管模型菌株提供了概念验证，但大多数人类微生物仍难以遗传操作。CRISPR-Cas（尤其是Cas12a）、ACE、CRAGE、ClosTron和优化转化方法等进展正突破这些障碍，使精准工程化多样化非模型生物成为可能，并将其应用扩展到肿瘤靶向、免疫调节和病原控制。未来进展取决于合成生物学与高通量培养、多组学分析和计算模型的整合，以设计能够动态响应宿主和环境信号的可编程多菌群 consortium。同样关键的是开发标准化工具包、菌株特异性遗传资源和严谨的生物安全框架以支持临床转化。弥合模型与非模型微生物间的差距，将是释放人类微生物组全部治疗潜力的下一个前沿。