根癌农杆菌C58染色体构型调控毒力与适应性平衡的机制研究

本研究针对细菌染色体构型如何直接调控其适应性这一关键科学问题，通过CRISPR/Cre-loxP技术构建了四种近等基因型根癌农杆菌C58变体（单/双染色体、线性/环状），发现单染色体构型显著提升生长速率和胁迫耐受性（如UV抗性），但降低毒力基因（vir）表达和植物转化效率；双染色体构型则优化了致病性。全转录组分析揭示了染色体架构依赖的基因表达模式，为细菌基因组进化与宿主适应性策略提供了机制性见解。

　　

细菌的染色体构型长期以来被认为是影响其进化与适应性的关键因素，但具体机制仍不明确。根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）C58作为一种兼具自由生存和病原特性的模式细菌，其天然存在多复制子基因组（包括环状染色体C1、线性染色体C2、大质粒pAt和致瘤质粒pTi），为研究染色体构型的功能提供了理想体系。近年来研究发现，不同农杆菌菌株甚至同一菌株内存在染色体构型变异（如单环、单线、双环或环-线混合），但这些结构差异如何直接影响细菌的生理特性、竞争力和致病性仍缺乏直接证据。

为解决这一问题，研究人员利用高效的CRRNA引导的基因组工程工具INTEGRATE（INsertion of Transposable Elements by Guide RNA–Assisted TargEting）结合Cre-loxP重组系统，在根癌农杆菌C58中构建了四种近等基因型变体：野生型（WT，环C1+线C2）、C2环化型（Cir）、天然融合线性染色体型（FL）以及人工环化融合染色体型（FCir）。通过比较这些菌株的生长特性、胁迫响应、菌间竞争和毒力表达，并结合全基因组高通量染色体构象捕获（Hi-C）、转座子插入测序（Tn-seq）和RNA测序（RNA-seq）技术，系统揭示了染色体构型对细菌行为的深远影响。

研究过程中，作者主要应用了以下关键技术：INTEGRATE/Cre-loxP介导的染色体工程改造、Hi-C三维基因组构象分析、Tn-seq必需基因鉴定、RNA-seq转录组分析、植物瞬时转化（RUBY报告系统）和稳定转化实验、紫外/氧化胁迫耐受性试验以及体外竞争共培养实验。所有菌株均以C58为遗传背景，通过基因操作获得不同构型变体。

研究结果

自然融合与人工环化农杆菌染色体

通过Hi-C和Tn-seq分析，团队成功验证了四种菌株的染色体构型：WT保持环C1+线C2；Cir为环C1+环C2；FL为线性融合染色体；FCir为环化融合染色体。Tn-seq显示，在线性染色体末端稳定中起关键作用的端粒酶基因telA在环化菌株（Cir和FCir）中变为非必需，而复制与分离相关基因（如xerC/xerD）在融合菌株中仍为必需，表明不同构型菌株保留了核心复制与分离机制。

单染色体构型增强适应性与胁迫耐受性

生长实验表明，单染色体菌株（FL和FCir）在富培养基（YEP）和最低培养基（AB）中均表现出更快的生长速率（倍增时间缩短20-30%）和更高的竞争适应性。在连续传代竞争实验中，单染色体菌株显著压倒双染色体菌株。此外，这些菌株对紫外（UV）照射和氧化胁迫（H₂O₂）表现出更强耐受性，提示单染色体构型有利于自由生存环境下的适应性。

单染色体构型降低毒力

毒力基因诱导实验（使用P_virB-mCherry报告系统）发现，双染色体菌株（WT和Cir）的vir基因（如virA/G、virB、chvG/I）表达显著高于单染色体菌株（FL和FCir）。植物侵染实验（Kalanchoe叶片肿瘤生成和本氏烟瞬时转化）证实，单染色体菌株的致病性和T-DNA传递效率下降。值得注意的是，FCir菌株在长期传代中易丢失Ti质粒，进一步削弱其毒力。

染色体构型依赖的基因表达模式

RNA-seq和加权基因共表达网络分析（WGCNA）揭示了染色体构型对全局基因表达的调控：双染色体菌株高表达毒力相关基因（如vir系列、植物代谢相关基因），而单染色体菌株上调应激响应（如phyR-like、ligD、Ku、catE）、DNA修复和细菌竞争相关基因（如Ⅵ型分泌系统基因）。这些表达差异与表型高度一致，说明染色体构型通过转录重编程直接影响细菌的生态与致病策略。

结论与意义

本研究通过精准的基因组工程技术，首次在近等基因背景下系统揭示了染色体构型对根癌农杆菌C58生理与致病性的直接影响：单染色体构型提升生长竞争力和胁迫耐受性，适用于自由生存环境；而双染色体构型则优化毒力基因表达，利于病原生活方式。这种“适应性-毒力”权衡反映了细菌在进化过程中通过基因组构型变异适应不同生态位的策略。研究不仅深化了对细菌基因组架构功能的理解，也为农业微生物改造（如增强益生菌适应性或减弱病原菌毒力）提供了理论依据和技术途径。该成果发表于《Science Advances》，对微生物进化生物学和植物病原工程防控具有重要指导意义。