α-半乳糖苷酶(AGal)催化机制与计算机辅助设计：提升低聚半乳糖(GOS)合成的分子见解与工程策略

本研究针对α-半乳糖苷酶(AGal)底物特异性及水解/转糖基机制不清的问题，通过量子力学/分子力学(QM/MM)模拟与机器学习，揭示了糖苷化步骤的能垒(ΔG?=17.8 kcal·mol?1)及关键残基(Trp188/Phe235)的功能，成功设计出提升低聚半乳糖合成的突变体（如W188A使ΔG?降低10 kcal·mol?1），为酶理性设计提供了新范式。

　　

微生物来源的α-半乳糖苷酶(α-galactosidase, AGal)在农业和食品工业中广泛应用，既可降解棉子糖家族低聚糖，也能催化合成功能性低聚半乳糖(galactooligosaccharides, GOS)。然而，由于对酶底物特异性及水解/转糖基反应决定因素的认知局限，理性设计一直面临挑战。

本研究采用量子力学/分子力学(quantum mechanics/molecular mechanics, QM/MM)模拟方法，深入解析了酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中糖苷水解酶家族27(glycoside hydrolase family 27, GH27) AGal的催化机制与底物特异性。研究发现：该酶通过Koshland双置换机制催化水解，并以外切模式切割线性半乳甘露聚糖。自由能计算表明，糖苷化步骤是决速步，能垒(ΔG^?)为17.8 kcal·mol^?1，与实验数据高度吻合。尤其值得注意的是，4-OH···亲核基团的相互作用对过渡态（特别是去糖基化步骤）起到关键稳定作用。

通过机器学习分析，研究团队进一步鉴定出正结合子位点上的Trp188和Phe235为突变热点。在评估六种AGal变体的计算机模拟转糖基活性时发现：Phe235的芳香族取代（F235Y和F235W）更利于蔗糖底物的亲核攻击(nucleophilic attack, NA)；而W188A、W188R和F235S则显著降低乳糖反应能垒。其中，W188A变体表现出卓越性能——ΔG^?降低10 kcal·mol^?1，NA距离缩短0.3 ?，溶剂可及表面积增加约500–600 ?²。

这些结果不仅揭示了AGal催化过程的分子机理，更彰显了计算机辅助子位点工程在提升GOS合成效率方面的巨大潜力，为工业用酶的设计优化提供了新策略。