利用CRISPR/Cas9介导的非同源末端连接技术创制水稻ALS广谱抗除草剂种质资源

本研究针对水稻直播田杂草防控难、除草剂残留影响轮作等问题，通过CRISPR/Cas9介导的NHEJ技术靶向编辑OsALS基因，结合全阶段筛选体系，成功获得对咪唑啉酮类、嘧啶硫代苯甲酸酯类、磺酰氨基羰基三唑啉酮类和磺酰脲类除草剂具有广谱抗性的ALS三重突变体（P171T/R172G/M174L）。该突变体在保持农艺性状稳定的同时，抗性倍数达1153倍，为水稻抗除草剂育种提供了新策略。

　　

随着现代农业的发展，除草剂已成为农田杂草防控不可或缺的工具。然而，长期使用单一除草剂导致杂草抗性进化、除草剂残留影响后续作物轮作等问题日益突出。在中国，随着劳动力成本上升，水稻种植方式正从移栽向直播转变，但直播田的杂草和杂草稻难以控制，直接影响水稻产量。此外，一些长残留除草剂的使用还会影响后茬作物种植。这些问题严重制约了水稻直播技术的推广和稻作生产的可持续性，迫切需要开发抗除草剂遗传种质资源。

乙酰乳酸合酶（Acetolactate synthase，ALS）是支链氨基酸（缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸）生物合成途径中的关键酶，存在于植物和微生物中，是多种除草剂的作用靶点。ALS抑制剂包括五类主要除草剂：咪唑啉酮类（Imidazolinones，IMI）、磺酰脲类（Sulfonylureas，SU）、嘧啶硫代苯甲酸酯类（Pyrimidinylthiobenzoates，PTB）、磺酰氨基羰基三唑啉酮类（Sulfonylaminocarbonyltriazolinones，SCT）和三唑并嘧啶类（Triazolopyrimidines，TP）。这些除草剂通过抑制ALS活性，导致植物生长停滞、枯萎死亡。

大多数籼稻品种对某些SU和PTB类除草剂（如苄嘧磺隆、吡嘧磺隆和双草醚）具有天然耐受性，而粳稻品种的耐受性较弱。两种亚种都对所有IMI类和部分SCT类除草剂敏感。由于许多SU类除草剂因残留期长而被禁用，加之杂草抗性的进化，拓宽水稻抗除草剂谱显得尤为迫切。

ALS基因突变可赋予植物对ALS抑制类除草剂的抗性。世界上首例ALS抗性突变是在地肤（Kochia scoparia）中发现的P171T突变，使地肤对SU类除草剂产生抗性。随着ALS抑制类除草剂的广泛使用，在A96、P171、D350、W548和S627等位点及其附近出现了多种突变，这些位点位于除草剂结合区域。研究人员还通过人工创制ALS突变来获得更高或更广谱的抗性。2002年在美国首次商业化推广的Clearfield水稻就是通过EMS诱变获得ALS-G628E突变。W548L/S627I双突变可使水稻对双草醚产生抗性，该突变同样使小麦、大豆和竹类对双草醚产生抗性。S627I单突变可用于创制抗嘧草醚的高羊茅。G95A突变的ALS使水稻对PTB类除草剂具有高度特异性抗性。携带W548M突变的"洁田"水稻品种对ALS抑制类除草剂具有广谱抗性。在大豆田喷施IMI除草剂后种植的粳稻品种"津晶818"中发现了S627N突变，导致对咪唑乙烟酸的抗性。通过EMS诱变在籼稻中诱导出S627D和/或G152E突变的OsALS，表现出对咪唑乙烟酸的抗性。

除了传统诱变方法，最近发展的基因组编辑技术，特别是CRISPR/Cas技术，在加速种质改良和作物育种方面展现出巨大潜力。TALEN介导的同源定向修复（HDR）成功改变了内源ALS的特定DNA碱基，产生了抗性突变W548L/S627I。通过CRISPR/Cas介导的HDR，多个团队精确替换内源ALS为突变供体序列，产生W548L单突变或W548L/S627I双突变，获得抗双草醚的水稻。通过CRISPR/Cas介导的非同源末端连接（NHEJ）筛选出G628W突变的OsALS，对咪唑乙烟酸和咪唑烟酸具有高水平耐受性。碱基编辑和引物编辑也促进了抗除草剂ALS基因修饰。通过碱基编辑器创制的新型三重OsALS突变体（P171F/G628E/G629S）对五种除草剂（烟嘧磺隆、咪唑烟酸、吡唑磺草胺、氟酮磺隆和双草醚）具有耐受性。通过碱基编辑产生P171F和R190H单OsALS突变体，具有双草醚耐受性。通过碱基编辑获得S627G突变的ALS。通过碱基编辑将A96V突变引入OsALS，产生抗甲氧咪草烟的水稻。通过引物编辑也诱导出W548L-OsALS突变。

在这项发表于《Rice》的研究中，欧阳超等人利用CRISPR/Cas9介导的NHEJ技术在籼稻ALS基因中诱导突变，结合组织培养过程中的全阶段选择压力（选择、再生和生根阶段），成功获得了对不同ALS抑制类除草剂具有抗性的突变体，并鉴定出多个新型OsALS突变。该研究为创制作物抗除草剂种质资源提供了有效方法。

研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用CRISPR/Cas9介导的NHEJ基因编辑技术靶向OsALS基因的P171和S627位点；建立基于双草醚（BS）和甲氧咪草烟（IMX）的全阶段筛选体系（包括选择、再生和生根阶段）；通过农杆菌介导法将编辑载体导入水稻品种Heguangsimiao；采用酶学分析方法测定突变ALS蛋白的催化效率和除草剂抑制特性；通过田间试验评估突变体的农艺性状和除草剂耐受性。

CRISPR/Cas9靶点设计与载体构建

研究人员设计了两个sgRNA，分别靶向OsALS的P171和S627位点，位于基因组DNA的反义链上。为提高籼稻转化效率，在pYLCRISPR/Cas9Pubi-H载体中添加了红色荧光蛋白表达盒（RFP），便于阳性愈伤组织筛选。sgRNA直接合成后连接到改良的二元载体中，分别由OsU6a启动子驱动。构建体分别命名为pCRGE-ALS171和pCRGE-ALS627，经测序验证后通过农杆菌介导转化导入水稻愈伤组织。

全阶段筛选促进抗除草剂突变体的产生

研究人员建立了ALS抑制类除草剂筛选体系，通过在培养基中添加BS或IMX进行全阶段筛选测试。在选择阶段，BS和IMX分别在0.18 mg/L和60 mg/L浓度下抑制非转基因愈伤组织的生长。在再生阶段，BS和IMX分别在0.068 mg/L和0.1 mg/L浓度下抑制非转基因愈伤组织分化成芽。在生根阶段，BS和IMX分别在1.36 mg/L和0.1 mg/L浓度下抑制非转基因芽的生长。通过农杆菌介导转化将二元载体pCRGE-ALS171和pCRGE-ALS627分别导入水稻，产生转基因幼苗后喷施除草剂筛选抗性株系。

在潮霉素（HN）筛选体系下，pCRGE-ALS171的1214个愈伤组织产生74株转基因株系，pCRGE-ALS627的897个愈伤组织产生65株转基因株系。在BS筛选体系下，pCRGE-ALS171的1004个愈伤组织产生16株转基因株系，pCRGE-ALS627的670个愈伤组织产生29株转基因株系。在IMX筛选体系下，pCRGE-ALS171的1015个愈伤组织产生20株转基因株系，pCRGE-ALS627的660个愈伤组织产生24株转基因株系。pCRGE-ALS171和pCRGE-ALS627载体在HN筛选体系下的转化效率分别为6.10%和6.35%，高于BS（1.59%/4.33%）和IMX（1.97%/3.64%）筛选体系。pCRGE-ALS627载体在BS和IMX筛选下均表现出比pCRGE-ALS171载体更高的除草剂存活率。

新型ALS突变赋予对ALS抑制类除草剂的广谱抗性

对抗性幼苗ALS基因的测序分析发现，P171靶位点有6个框内突变（Q169N/V170Q、P171I/R172G、P171T/R172G/M174L、P171M/R172V/R173E/M174L、V170A/P171N/R172T/R173S/M174L以及P171处的LN插入），S627靶位点有5个框内突变（G628缺失、S627I、G628L、G628W、G628E、S627H/G628H/G629-）。所有P171位点突变都是新变异，而只有S627位点的G628L和S627H/G628H/G629-是新变异。

P171T/R172G/M174L（命名为ALS-TM，三重突变）对咪唑乙烟酸（IMT）的抗性最高，其次是P171I/R172G和P171LN插入。Q169N/V170Q（命名为ALS-DM，双突变）对双草醚（BS）具有高抗性，其次是V170A/P171N/R172T/R173S/M174L。P171M/R172V/R173E/M174L突变表现出中等抗性。对于S627位点，G628L和S627H/G628H/G629-突变对BS具有中等抗性，所有其他突变先前已有报道。

研究人员在T2代进一步表征了ALS-TM突变体的除草剂抗性，以S627I突变体作为对照。ALS-TM突变体对IMT和咪唑烟酸（IMP）表现出强抗性，在5倍浓度下无生长抑制，在10倍浓度下存活。ALS-TM突变体对甲氧咪草烟（IMX）也具有高抗性，但略弱于对IMT和IMP的抗性。ALS-TM突变体对氟酮磺隆（FLZ）表现出强抗性，在4倍浓度下生长基本不受影响，甚至在12倍浓度下仍有部分幼苗存活。与野生型（WT）相比，ALS-TM进一步将BS抗性提高到40倍。ALS-TM对烟嘧磺隆（NSF）表现出中等抗性，在2倍浓度下显示轻微生长抑制，但在4倍浓度下存活。与对照ALS-S627I突变体相比，ALS-TM突变体对IMI、FLZ和NSF除草剂的抗性显著更高，而对BS的抗性相当。

新型OsALS突变体的表征

研究人员在植株和蛋白质水平上对新鉴定的ALS突变进行了表征。使用先前生成的ALS-W548L/S627I转基因植株作为对照，这些植株对BS和IMT都具有高抗性。

用5倍IMT处理的2-3叶期幼苗叶片样本进行ALS活性测定。WT植株的ALS活性在IMT喷施12-48小时后显著抑制，而ALS-TM突变体的ALS活性保持甚至增加。ALS-W548L/S627I转基因植株的ALS活性在12小时处理时略有下降，但随后逐渐增加，尽管略低于ALS-TM突变体。

除草剂响应试验也显示出明显差异。WT幼苗在18.75 g a.i./ha IMT（0.2倍）下严重抑制，在187.5 g a.i./ha（2倍）下死亡。相反，ALS-TM突变体和ALS-W548L/S627I转基因植株表现出高抗性。ALS-TM在1500 g a.i./ha（20倍）下无生长抑制，在1875 g a.i./ha（25倍）IMT下死亡率极低，而ALS-W548L/S627I在75 g a.i./ha（1倍）下正常生长，耐受750 g a.i./ha（10倍）IMT，但有中等抑制。

根据GR50和LD50值，与WT相比，ALS-TM和ALS-W548L/S627I在生长抑制方面的抗性分别提高1153.40倍和359.70倍，在死亡率方面的抗性分别提高102.49倍和45.26倍。值得注意的是，ALS-TM对IMT的抗性显著高于W548L/S627I转基因植株。

为了进一步表征ALS突变，研究人员在大肠杆菌中表达和纯化了重组蛋白，并分析了酶活性和对不同除草剂的响应。酶学分析显示，ALS-TM的Vmax与WT相似，Km显著增加，但总体催化效率相当。相反，ALS-DM的Vmax不到WT的10%，这可能导致了该突变体的致死性。尽管ALS-W548L/S627I的Vmax接近野生型，但其Km显著增加了22.78倍，可能导致其催化效率显著降低。

除草剂响应试验表明，ALS-TM对所有三种测试除草剂都具有高抗性，而ALS-DM对IMT表现出强抗性，对FLZ中等抗性，对NSF无抗性。基于IC50值，与WT相比，ALS-TM对IMT、FLZ和NSF的抗性分别提高了8,476.83倍、1,286.37倍和585.28倍。同时，ALS-W548L/S627I也对IMT表现出高抗性（4,208.94倍），对NSF高抗性（54.51倍），但对FLZ抗性较低（2.3倍）。

三重突变体在田间无明显产量损失

为了进一步评估ALS-TM突变体在田间应用的潜力，研究人员在除草剂处理和未处理条件下比较了其除草剂抗性和农艺性状与WT的表现。当在田间试验中对4-5叶期幼苗喷施5倍IMT时，所有WT植株在4周内死亡，而ALS-TM突变体保持正常生长，无可见药害。

尽管ALS-TM的株高略低于WT，但穗形态、籽粒形状或碾米品质相似。统计分析证实，无论IMT处理与否，ALS-TM和WT在分蘖数、每穗粒数、穗长、结实率和千粒重方面表现相当。值得注意的是，ALS-TM株高的一致降低与实验室中其他基因编辑株系的观察结果一致。这些结果表明，ALS-TM突变对关键农艺性状影响最小，同时赋予强大的除草剂抗性，突显了其在水稻育种计划中的前景。

OsALS三重/双突变基因可用作转基因选择标记

为了评估ALS突变是否可用作转基因选择标记，研究人员构建了二元表达载体pCALSTM和pCALSDM，以pCALS-548L/S627I作为对照，然后通过农杆菌介导转化分别感染水稻愈伤组织（RG237），使用不同的筛选体系。

所有三种二元表达载体都能从所有三种筛选体系中获得转基因幼苗。使用潮霉素-Hpt筛选体系时，它们都表现出高转化效率，超过20%。而当使用BS筛选体系时，pCALS-W548L/S627I的转化效率（24.18%）远高于pCALSTM（9.79%）和pCALSDM（3.66%）。然而，当使用IMX筛选体系时，pCALSTM（15.84%）和pCALSDM（12.76%）的转化效率远高于pCALS-W548L/S627I（7.62%）。这些载体和筛选方法为水稻遗传转化提供了替代选择。

当用IMT和BS处理这些T0转基因幼苗时，发现大多数pCALSTM转基因株系对5倍IMT具有高抗性，而pCALSDM转基因株系对IMT抗性较弱但能存活。pCALSTM、pCALSDM以及pCALS-W548L/S627I转基因株系对BS都表现出高抗性。这些结果进一步验证了先前关于ALS-TM和ALS-DM突变除草剂抗性的发现。

研究结论与意义

本研究通过CRISPR/Cas9介导的NHEJ技术结合全阶段筛选，成功在水稻ALS基因中诱导出多种新型突变，获得了对多种ALS抑制类除草剂具有广谱抗性的突变体。特别是ALS-TM三重突变（P171T/R172G/M174L）对IMI、PTB、SCT和SU类除草剂表现出极强的抗性，抗性倍数最高达1153倍，且不影响农艺性状和产量。

该研究不仅为水稻抗除草剂育种提供了新的种质资源，还展示了CRISPR/Cas9介导的NHEJ在创制新型突变方面的优势。与传统方法相比，这种方法能够产生更多样化的突变类型，结合全阶段筛选可高效筛选出具有理想性状的突变体。

此外，研究发现ALS-TM和ALS-DM突变可作为转基因选择标记，用于水稻遗传转化，这为植物基因工程提供了新的选择工具。ALS-TM突变体对IMT的高抗性使其能够作为基础研究的可靠工具，促进实验室研究中转基因材料的选择和鉴定。

这项研究的意义在于：一是为解决水稻直播田杂草防控难题提供了有效解决方案；二是拓宽了水稻抗除草剂谱，减少了对特定除草剂的依赖；三是展示了基因编辑技术在作物改良中的巨大潜力；四是为其他作物抗除草剂育种提供了可借鉴的方法策略。

总之，该研究通过创新性的方法策略，成功创制了具有广谱抗除草剂特性的水稻新种质，为水稻生产的可持续发展提供了重要技术支持，对推动现代农业发展具有重要意义。